RAZMAZOVANJE BAKTERIJ: ZNAČILNOSTI IN PRIPRAVA - BIOLOGIJA - 2025

Bakterijska brisa je tanka folija razmaz suspenzije bakterijskih mikroorganizmov, ki je bila vložena v prozorno stekleno ploščo ali drsnika, za opazovanje pod svetlobnim mikroskopom.

Podaljšek v obliki filma se izvede tako, da se mikroorganizmi čim bolj ločijo, saj če so združeni, opazovanje ni jasno.

Slika 1. Bakterijski razmaz, opažen pod skenirnim elektronskim mikroskopom. Vir: pixbay.com

Pri preučevanju bakterijskih kultur se za boljšo analizo uporabljajo tehnike priprave, fiksacije in obarvanja. Zaradi majhnosti mikroorganizmov je za njihovo opazovanje nujno potrebna uporaba optičnega mikroskopa.

Optični mikroskopi so bistveni instrumenti za opazovanje razmazov. V njih so uporabljene optične leče in svetloba, ki omogočajo ogled vzorcev z veliko povečavo.

Na splošno žive celice nimajo večinoma obarvanih struktur, s svetlobnim mikroskopom gledamo, da so brezbarvni, prozorni vzorci in kažejo zelo malo notranjega kontrasta in s svojim okoljem.

Opazovanje s preprostim optičnim mikroskopom s svetlim poljem, brez uporabe pomožnih tehnik obarvanja, je zelo omejeno in se uporablja le v nekaterih primerih, na primer pri opazovanju gibanja mikroorganizmov.

Za optimalno opazovanje mikroorganizmov je treba vzpostaviti ravnovesje med kontrastom in ločljivostjo. Podatkov o celicah ni mogoče videti pod mikroskopom, tudi pri visoki ločljivosti; Uporaba barvil je potrebna s tehnikami obarvanja, ki zagotavljajo kontrast za opazovanje.

Značilnosti kakovostnega bakterijskega razmaza

Odličen kontrast

Za dosego odličnega kontrasta obstajajo sofisticirani mikroskopi, imenovani fazni kontrastni mikroskopi, diferencialni interferenčni mikroskopi in mikroskopi s temnim poljem. Ta vrsta mikroskopa se med drugim uporablja za opazovanje bakterijskih struktur, kot so plašči in nitke.

Obarvanje je preprosta tehnika za povečanje kontrasta, ki jo dosežemo s svetlobnim mikroskopom. Pri tej tehniki je mogoče uporabiti različne madeže, ki bistveno izboljšajo mikroskopsko opazovanje.

Madeži se nanesejo neposredno na razmaze ali podaljške suspenzij mikroorganizmov na diapozitivih, predhodno posušene in pritrjene.

Dobro popraviti

Fiksacija je tehnika, ki se uporablja za ohranjanje celičnih struktur; povzroči inaktivacijo mikroorganizmov in oprijem na steklo stekelca. Obstajajo različni načini pritrditve: toplotna fiksacija in kemična fiksacija.

Fiksacija toplote

To je najbolj razširjena metoda opazovanja bakterijskih razmazov. Tehnika je sestavljena iz prenašanja bakterijske suspenzije razmaza skozi plamen vžigalnika. Ta tehnika je sposobna ohraniti zunanjo morfologijo bakterij, vendar uniči njihove notranje strukture.

Kemična fiksacija

Za kemično fiksacijo se med drugim uporabljajo kemikalije za konzerviranje, kot so formaldehid ali formaldehid, etanol in ocetna kislina. Prednost uporabe sredstev za fiksiranje je, da se doseže ohranitev notranjih celičnih struktur mikroorganizmov.

Slika 2. Krvni razmaz. Vir: Bobjgalindo, z Wikimedia Commons

Dobro obarvanje

Najpogostejši postopki obarvanja predhodno posušenega in fiksiranega razmaza so pozitivno ali preprosto obarvanje, diferencialno obarvanje in negativno obarvanje. Obstajajo tudi posebne tehnike obarvanja določenih celičnih struktur (kapsula, spore, flagele).

Pozitivno obarvanje ali preprosto obarvanje

Pozitivno ali preprosto obarvanje je najpogosteje uporabljena tehnika barvanja razmaza. Uporablja barvila, ki se lahko vežejo na določene mikrobne strukture, kar jim omogoča opazovanje pod mikroskopom.

Ta barvila imajo v svoji kemijski strukturi kromoforne skupine (obarvani del) z izmeničnimi dvojnimi vezmi in enojnimi vezmi (konjugacija). Te vezi lahko vzpostavijo ionske ali kovalentne vezi z nekaterimi celičnimi strukturami.

Barvila, uporabljena pri pozitivnem ali preprostem obarvanju, so večinoma kemični derivati ​​anilina (obarvane organske soli).

Po drugi strani lahko med barvili najdemo nekatera z osnovnim pH, druga pa s kislim pH.

Osnovna barvila

V osnovnih barvilih ima skupina kromofor pozitiven električni naboj. Velika večina prokariotskih mikroorganizmov ima nevtralen notranji pH, njihova celična površina pa je negativno nabit. Skozi to elektrostatično interakcijo se kromofor veže na celico in jo obarva.

Primeri osnovnih barvil so metilen modro, kristalno vijolično, malahitno zeleno, osnovni fuscin, med drugim tudi safranin.

Kisla barvila

V kislih barvilih ima skupina kromofor negativni električni naboj. Uporabljajo se za obarvanje beljakovin s pozitivno nabitimi amino skupinami. Primeri kislih barvil so kisli fuksin, rožna bengalka, rdeča Kongo in eozin.

Diferencialno obarvanje

Tehnika diferencialnega obarvanja je sestavljena iz nanašanja dveh barvil različnih barv ali jakosti za razlikovanje različnih mikroorganizmov pod mikroskopom. Madež po Gramu in madež na kislinsko-alkoholno odpornost sta najpogosteje uporabljeni diferencialni madeži v bakteriologiji.

Madež po Gramu se uporablja kot predhodni test, da poznamo obliko, velikost, razvrščanje celic, pa tudi vrsto celične stene. S testom na Gram madeže se bakterije celične stene razvrstijo v gram pozitivne bakterije in gram negativne bakterije.

Negativno obarvanje

V tej tehniki se uporabljajo kemična barvila, ki ne prodrejo v notranjost celice, ampak naredijo medij, v katerem so mikroorganizmi videti kot črno ozadje.

Pri tehniki negativnega obarvanja je razmaz narejen s kapljico indijske črnila ali suspenzije nigrosina, ki po sušenju pri sobni temperaturi tvori neprozoren film za prehod svetlobe. Na ta način se mikroorganizmi pojavljajo kot svetle oblike na temnem ozadju.

Priprava

A. Smeh

1.- Drsnike zelo dobro operemo, osušimo z vpojnim papirjem in jih nalepimo. Na etiketi mora biti navedena vsebina pripravka, datum in ime osebe, ki ga je predelala.

2.- Prižgite vžigalnik in sterilizirajte zanko za inokulacijo v plamenu do svetlo rdeče barve.

3.- Pustite, da se ročaj ohladi.

4.- Vzemite epruveto za bakterijsko kulturo, odstranite pokrovko in hitro mimo ustja epruvete blizu plamena gorilnika (plamen).

5.- V epruveto, v kateri je bakterijska kultura, vstavite zanko za inokulacijo in vzemite vzorec.

6.- Če je kultura v tekočem mediju, vzemite vzorec z ročajem na sredino diapozitiva in ga previdno razporedite v krog s premerom približno 2 cm.

7.- Ponovno sterilizirajte zanko za inokulacijo.

8.- Pustite, da se razmaz posuši na zraku.

9.- Ponovite korake 3 do 8 trikrat.

10.- Če je kultura v trdnem mediju, je treba na tobogan predhodno kapljico destilirane vode. To naredimo za mešanje majhnega vzorca kulture, ki je bil odvzet z zanko za inokulacijo, kot je opisano v korakih 2 do 5 (aseptični pogoji).

11.- Razredčeni vzorec raztopite s kapljico vode na diapozitivu in ponovite trikrat.

B. Pritrditev

1.- Dodajte dve kapljici metanola ali absolutnega etanola suhim razmazom - iz kultur v tekočem mediju.

2. - Pustite, da se zrak izsuši stran od vžigalnika.

3.- Če razmaz izhaja iz kulture v trdnem mediju, se suhi razmaz pritrdi s toploto in jo 2 do 3-krat hitro prepelje skozi najbolj vroč del svetlejšega ognja.

4.- Dotaknite se spodnjega dela razmaza z dorzalnim delom leve roke (za desničarje; sicer uporabite desno roko) in preverite, ali je hladen.

C. Preprosto obarvanje

1.- Dodajte 2 kapljici izbranega madeža v razmaz in pustite delovati v času, ki je potreben v posebnih protokolih za vsak madež (običajno med 1 in 5 minutami).

2.- Nekateri madeži zahtevajo uporabo toplote za njihovo aktivacijo; v tem primeru je treba biti zelo previden pri segrevanju drsnika v vžigalniku (manipulirajte s pinceto in se izogibajte vrenju). Pregrevanje razmaza lahko uniči celice, ki jih je treba opazovati.

3.- Odvečno barvilo odstranite s spiranjem z destilirano vodo iz piketa. Odstranite vodo za pranje, tako da nežno tapnete drsnik po njenem robu, nagnjen na delovno mizo.

4.- Omogočite sušenje zraka.

5.- Glede na vrsto opazovanja se na tej stopnji uporablja ali ne. Pokrivalo ščiti in ohranja razmaz. Če se na tej stopnji opravi opazovanje potopitve olja, se ne uporabljajo pokrovčki, vendar razmaza ni mogoče ohraniti.

D. Dokončno ohranitev razmaza

1.- Razmaz zaporedoma potopite v vsako od spodaj navedenih raztopin, in sicer najmanj 5 minut. Namen teh "kopeli" je popolna dehidracija razmaza. Pred nanosom razmaza v naslednjo kopel je treba vsak reagent temeljito odcediti.

Vrstni red dehidracijskih kopeli je naslednji:

1. 70% etanol
2. 95% etanol
3. Čisti aceton
4. Zmes aceton-ciklol 1: 1
5. Ksilol

Nato pustite, da se posuši na zraku.

2. - Namestite pokrov, najbolje 22 × 22 mm s kanadskim balzamom ali drugim sredstvom za pritrditev.

Reference

1. Briggs, G. (1965). Vzročni dejavniki pri mikrobioloških laboratorijskih nesrečah in okužbah. Biološki laboratoriji ameriške vojske. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG in Welch, CT (2017). Mikrobiologija: laboratorijski priročnik. Pearson.
3. Holt, urednik JG. (1977). Krajši Bergeyjev priročnik o odločujoči bakteriologiji. 8 ^th Baltimore: The Williams in Wilkins Co.
4. Johnson, TR in Case; CL (2018). Laboratorijski poskusi iz mikrobiologije. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostična mikrobiologija. 14 ^th St. Louis, ZDA: Elsiever, Inc.