TSI AGAR: UTEMELJITEV, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2025

Agar TSI ali trojne agar sladkor železo je trdna medij, ki služi kot je biokemični test za usmerjanje začetno identifikacijo po Gramu negativnih bacilov. Temelji na prikazu fermentacije prisotnih sladkorjev in proizvodnji vodikovega sulfida in plina.

Njegova sestava in osnova sta zelo podobni Kliglerjevemu testu z železom, s to razliko, da slednji vsebuje le glukozo in laktozo. Namesto tega, kot pove že njegovo ime, trojni sladkorni agar s sladkorjem vsebuje tri fermentirane ogljikove hidrate: glukozo, laktozo in saharozo.

Slike preskusa TSI z različnimi mikroorganizmi A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Vir: Witmadrid, iz Wikimedia Commons

Poleg tega ima TSI medij štiri beljakovinske derivate, zaradi katerih je zelo hranljiv agar: ekstrakt kvasa, mesni ekstrakt, pepton in proteozni pepton. Vsebuje tudi železov amonijev sulfat, natrijev tiosulfat, natrijev klorid, fenol rdeč in agar.

Nesposobnost mikroorganizma za fermentacijo glukoze, ki je prisotna v gojišču, ga takoj izključi iz pripadnosti družini Enterobacteriaceae. Zato je ta preskus bistven pri odločanju, katero identifikacijsko pot uporabiti za določitev rodu in vrste.

Vsak laboratorij se odloči, ali bo sodeloval z agarjem TSI ali z železnim agarjem Kligler.

Osnove

Vsaka od spojin izpolnjuje funkcijo znotraj medija.

Natrijev klorid in agar

Natrijev klorid je nujen za ohranjanje osmotskega ravnovesja medija. Medtem ko agar daje trdno konsistenco.

Indikator PH (rdeče)

PH pripravljenega medija je uravnotežen na 7,3 in pH indikator (fenolno rdeč) postane rumen pod 6,8. To pomeni, da bodo majhne količine kislin, ki nastanejo s fermentacijo sladkorjev, spremenile medij iz rdeče-oranžne v rumeno.

Če ne pride do fermentacije, bo medij alkaliniziral z uporabo peptonov, ki bodo iz rdeče-oranžne v močno rdečo.

Proteinski derivati ​​(ekstrakt kvasa, mesni ekstrakt, pepton in proteozni pepton)

Ko bakterije presnavljajo beljakovine, ki so prisotne v agarju TSI, nastajajo amini, ki alkalizirajo medij (predvsem na stopnji posnetka), ker je za reakcijo potreben kisik. Amini obarvajo okvir v svetlo rdeči barvi.

Toda to bo odvisno od sposobnosti bakterij, da fermentirajo ogljikove hidrate ali ne.

Fermentacija ogljikovih hidratov (glukoza, laktoza in saharoza)

Študija fermentacije sladkorjev lahko da več slik in vsaka se razlaga različno. Testna razlaga mikroorganizme deli na 3 kategorije: ne-fermenterji glukoze, ne-fermentorji laktoze in fermentorji laktoze / saharoze.

Upoštevati je treba, da je količina glukoze v mediju omejena, medtem ko je koncentracija laktoze in saharoze 10-krat večja.

Bakterije iz družine Enterobacteriaceae in drugi mikroorganizmi, ki fermentirajo glukozo, bodo ta sladkor začeli fermentirati, saj je najpreprostejši ogljikov hidrat za energijo.

Po drugi strani sta laktoza in saharoza zapleteni ogljikovi hidrati, ki jih je treba razgraditi in pretvoriti v glukozo, da lahko vstopijo v cikel Embden-Meyerhof.

- Mikroorganizmi, ki ne fermentirajo glukoze

Ko inokulirani mikroorganizem ne more fermentirati glukoze, še manj bo lahko fermentiral druge ogljikove hidrate. Zato se tu ne tvorijo kisline, vendar se z uporabo peptonov tvori amini v poskoku.

V tem primeru se okvir spremeni v močnejšo rdečo barvo, dno epruvete pa lahko ostane nespremenjeno ali pa se tudi alkalizira, tako da cela cevka postane rdeča.

Razlaga: K / K pomeni alkalno poševno / alkalno ali nevtralno dno

Na sliki na začetku članka glej sliko cevi D.

Ta rezultat kaže, da mikroorganizem ne spada v družino Enterobacteriaceae.

- Mikroorganizmi, ki ne fermentirajo laktozo / saharozo

Če bakterije lahko fermentirajo glukozo, ne pa laktozo ali saharozo, se bo zgodilo naslednje:

Bakterije bodo porabile vso prisotno glukozo po približno 6 do 8 urah, tako da bodo lahko zakisale tako poševno kot blok; to pomeni, da bo agar popolnoma porumenel. Ko pa se glukoza izčrpa in laktoze in saharoze ni mogoče uporabiti, bodo bakterije začele presnovo beljakovin.

Ta reakcija potrebuje kisik, zato se na površini (poševno) pojavi razgradnja peptonov. Proizvedeni amini alkalizirajo, da se okvir spremeni iz rumene v rdečo. Ta reakcija se kaže po 18 do 24 urah inkubacije.

Razlaga: K / A pomeni alkalno poševno in kislo vato.

Na sliki na začetku članka glejte sliko cevi B.

- mikroorganizmi, ki fermentirajo laktozo / saharozo

Mikroorganizmi, ki lahko fermentirajo laktozo in saharozo, očitno lahko fermentirajo glukozo. Potem ko se izčrpa najmanjša količina glukoze v mediju, nastali piruvat začne presnavljati v kisline skozi aerobni Krebsov cikel, v obdobju 8 do 12 ur pa bo ves medij rumen.

Če bakterije lahko razgradijo laktozo ali saharozo, bodo kisline še naprej nastajale in po 18 do 24 urah bo cela cev - poševno in vtičnica - še naprej rumenela.

Treba je opozoriti, da se uporaba glukoze izvaja na dva načina: eden aerobno na poskoku cevi in ​​drugi anaerobno na dnu epruvete.

Interpretacija: A / A pomeni kislo poševno / kislo dno. Plin lahko ima ali ne.

Na sliki na začetku članka glej sliko cevi A.

Proizvodnja plina

Nekateri mikroorganizmi so sposobni proizvajati plin med fermentacijo sladkorjev. Plin se v cevi dokaže s tlakom, ki ga izvaja v agarju. Tlak povzroči nastanek mehurčkov ali premik agarja. Včasih lahko tvorba plina pokvari medij.

Pomembno je, da se v času setve medija za TSI punkcija naredi čisto skozi sredino agarja, dokler ne doseže dna. Če je prebijanje preusmerjeno proti stenam cevi, lahko pri proizvodnji plina povzroči lažne pozitivne učinke, saj bo pobegnil skozi napačno oblikovan kanal.

Za proizvodnjo plina, pa tudi za reakcije, ki se pojavljajo v konju agarja, je potreben kisik, zato je priporočljivo, da se cev pokrije z bombažnim čepom, če pa se uporablja bakelitni pokrov, ne sme biti popolnoma tesen.

O proizvodnji plina se poroča kot pozitivno (+) ali kot negativno (-).

Vzorci tvorbe plina. Vir: Shema mag. Marielsa Gil. Vir slik: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, prek Wikimedia Commons

Natrijev tiosulfat in železov amonijev sulfat

Bakterije, ki lahko proizvajajo vodikov sulfid (brezbarven plin), prevzamejo žveplo iz natrijevega tiosulfata, ki je prisoten v mediju. Po H ₂ tvorjen S, reagira z železovim amonijevim sulfatom, za proizvodnjo železove sulfida (vidna črna oborina).

Proizvodnja H ₂ S je poročana kot pozitivna (+) ali negativna (-).

Na sliki na začetku članka glej sliko cevi C.

Priprava

Natehtamo 62,5 g dehidriranega medija s trikratnim železovim agarjem (TSI) in ga raztopimo v enem litru destilirane vode.

Segrevajte, dokler se agar popolnoma ne raztopi. Kuhajte minuto in pogosto mešajte. Z bombažnimi pokrovčki razdelite 4 ml gojišča v epruvete 13/100.

Sterilizirajte 15 minut v avtoklavu pri 121 ° C. Odstranite iz avtoklava in pustite počivati ​​pod kotom. Paziti je treba, da imata podnožje in podstavek enako razdaljo.

Shranjujte v hladilniku 2-8 ° C. Pred setvijo bakterijskega seva pustite, da se ogreje.

Barva dehidriranega medija je svetlo bež, pripravljen medij pa je rdeče-oranžen.

Končni pH pripravljenega medija je 7,3 ± 0,2.

Prijave

TSI test se pogosto uporablja na ravni mikrobiološkega laboratorija. Ta preskus je ključnega pomena za usmerjanje vrste testa, ki ga je treba uporabiti za identifikacijo rodu in vrste. Njegova dobra izvedba in interpretacija lahko prihrani material in delovno silo.

Če je rezultat TSI K / K in je test citokrom oksidaze pozitiven, je znano, da je treba med drugimi rodovi identificirati ne fermentirajoče Gram negativne palice, kot so Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia. Če je oksidazno negativna, je usmerjena proti rodom Acinetobacter, Stenotrophomonas itd.

Po drugi strani pa, če dobimo TSI A / A ali K / A in je test citokrom oksidaze negativen, več nitratov zmanjša na nitrite, bomo prepričani, da gre za mikroorganizem, ki spada v družino Enterobacteriaceae. V tem primeru se bo na poti identifikacije osredotočila na posebne teste za to skupino bakterij.

Po drugi strani pa, če dobimo sliko K / A ali A / A in test citokrom oksidaze pozitiven, bodo dodatni testi, ki jih je treba sestaviti, usmerjeni v identifikacijo fermentirajočih sevov, ki ne spadajo v družino Enterobacteriaceae, kot so: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio in Pasteurella.

TSI z vodikovim sulfidom, negativnim oksidazo, bo vodil identifikacijo naslednjih rodov družine Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella ali Salmonella.

S TSI, z malo ali zmerno vodikovega sulfida v alkalnem stožčasti z alkalno ozadjem in pozitivnim oksidaze bo vodilo uporabo testov za identifikacijo non-fermentacijo H ₂ S- proizvajajo gram-negativna palice, kot Shewanella putrefaciens.

Končno se lahko TSI uporabi za raziskovanje proizvodnje vodikovega sulfida v Gram pozitivnih bacilih, zlasti ob sumu na Erysipelothrix rhusiopathiae.

Posejano

Medij TSI je treba cepiti s čistimi kolonijami, izoliranimi v primarnih ali selektivnih kulturah. Če kolonijo vzamemo iz selektivnega gojišča, ki je bilo posejano z vzorci z mešano floro, je treba paziti le s površine, saj v spodnjem delu kolonije obstajajo sposobni sevi, inhibirani v tem mediju.

Zato zanke nikoli ne ohladimo na selektivnem mediju, nato pa kolonijo prevzamemo in inokuliramo s medijem TSI.

Setev bo opravljena z ravno zanko ali iglo. Narejena bo luknja, pri čemer pazimo, da gre skozi sredino sredine, dokler ne dosežemo dna, nato pa setev zaključimo z inokulacijo površine v cikcak obliki. Ne naredite dveh punkcij.

Inkubirajte pri aerobiozi pri 37 ° C 18-24 ur. Tolmačite trenutno, ne pred ne po njej.

Omejitve

TSI test je treba prebrati v 18 do 24 urah po inkubaciji. Prebiranje pred tem časom lahko daje napačno pozitivno fermentacijo A / A. Potem ko lahko branje po tem času povzroči napačno negativno podobo ne-fermentorja zaradi uživanja peptonov, ki alkalizirajo medij.

Reference

1. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testi za identifikacijo bakterij kliničnega pomena. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
4. "TSI agar." Wikipedija, prosta enciklopedija. 10. julij 2018, 08:09 UTC 10. februar 2019, 03:33 Dostopno na: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. TSI Agar (Trojni sladkorni agar s sladkorjem). 2015. Dostopno na: britanialab.com
6. BD Laboratoriji. Trojni sladkorni agar s sladkorjem (TSI Agar). 2003.Dostopno na: bd.com