MÜELLER HINTON AGAR: OSNOVA, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Mueller Hinton Agar ni selektivna, trdna hranilni medij sestavi mesa infuzije peptonski kislega kazeina, škroba, agar in destilirano vodo. Ta medij omogoča odlično rast mikrobov za večino hitro rastočih bakterij.

Prvotno sta jo ustvarila John Howard Müeller in Jane Hinton za izolacijo prehransko zahtevnih bakterij, kot sta Neisseria gonorrhoeae in Neisseria meningitidis. Vendar se je zaradi svojih značilnosti izkazalo, da je idealen za preučevanje občutljivosti na antibiotike, saj zagotavlja zanesljive in ponovljive rezultate.

Antibiogrami (Müeller Hinton agar). Vir: Dr Graham Beards iz en.wikipedia

Zato je Müeller Hinton Agar kulturni medij, ki sta ga sprejela Inštitut za klinične in laboratorijske standarde (CLSI) in Evropski odbor za testiranje občutljivosti na protimikrobne snovi za izvajanje preizkusa občutljivosti za protimikrobne snovi z difuzijsko metodo Kirby in Bauer.

Osnove

Kot neselektivno hranilno sredstvo je odličen za rast večine patogenih bakterij.

Po drugi strani pa zaradi preproste sestave snovi na njej zlahka difuzujejo, kar je bistvena značilnost preizkusa občutljivosti s pomočjo diskovne difuzijske metode.

Druga njegova značilnost je, da vsebuje majhno količino zaviralcev, kar omogoča učinkovito oceno sulfonamidov, trimetoprima in tetraciklin.

Vendar je treba upoštevati, da mora medij izpolnjevati določene pogoje za zagotovitev svojega pravilnega delovanja, vključno z:

Prilagajanje pH, globine agarja in ustrezne koncentracije timina, timidina, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ in Zn ⁺⁺ .

Vedeti morate tudi, da je metodologija standardizirana, zato morajo biti izpolnjeni vsi parametri, na primer:

Koncentracija inokuluma, koncentracija in ohranjenost diskov z antibiotiki, namestitev ustreznega števila diskov na agar, razdalja med enim in drugim diskom, strateška namestitev nekaterih antibiotikov, ozračje, temperatura in čas inkubacija.

Priprava

Odtehtamo 37 g dehidriranega sredstva Müeller Hinton in raztopimo v 1 litru destilirane vode. Med mešanjem segrevamo medij, da olajšamo raztapljanje. Vremo 1 minuto.

Avtoklav se sterilizira pri 121 ° C 15 minut. Ko odstranite avtoklav, morate bučko postaviti v vodno kopel pri 50 ° C, da se ohladi. V sterilno petrijevo posodo premera 10 cm vlijemo 25 do 30 ml.

Plošče morajo biti s povprečno debelino 4 mm (idealno), pri čemer je dovoljeno območje 3-5 mm.

Če želite pripraviti krvni agar z uporabo Müeller Hinton agarja kot osnove, pred serviranjem na krožnike nalijte 5% sterilno in defibrinirano jagnječino kri.

Končni pH medija mora biti med 7,2 in 7,4.

Vložite in hranite v hladilniku, do uporabe. Pred uporabo pustite ploščo na sobni temperaturi.

Barva pripravljenega medija je svetlo bež.

Prijave

Uporablja se za izvajanje antibiograma ali testa občutljivosti na antibiotike za najbolj hitro rastoče nezahtevne patogene.

Če je agar dopolnjen s krvjo, se med drugim uporablja za izvajanje antibiograma zahtevnih mikroorganizmov, kot so: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis. Uporabljali so ga tudi za izolacijo Legionella pneumophila.

Antibiogramska tehnika

Pred izvedbo antibiograma je treba pripraviti bakterijsko raztopino, ki ustreza 1,5 x 10 ⁸ celic.

Za to se odvzamejo 3 do 4 kolonije čiste kulture in suspendirajo v sojinem tripticaznem juhu ali v juhi Müeller Hinton, inkubirajo 2 do 6 ur, koncentracija pa se uravna s sterilno fiziološko raztopino, primerja s standardom Mac Farland 0,5%.

Če so zahtevni mikroorganizmi, lahko kolonije suspendiramo do koncentracije 0,5% Mac Farland. Nato se plošča Müeller Hinton poseja z brisom, impregniranim s pripravljeno raztopino bakterij.

Da bi to naredili, je bris potopljen v raztopino, nato pa se odvečna tekočina odstrani s pritiskom na stene cevi. Takoj zatem blazinico prenesemo po celotni površini, pri čemer ne ostanemo nedotaknjeni, nato pa se plošča rahlo zasuka in ponovno seme. Operacija se ponovi še 2-krat.

Pustite stati 10 minut in nato vstavite diske z antibiotiki s sterilnimi kleščami, tako da med njimi pustite vrzel 24 mm. Potem, ko vsak disk položite na agar, ga rahlo pritisnite s pinceto, da zagotovite, da se dobro oprijemata.

Ko je postopek končan, ploščo obrnemo in inkubiramo pri 35-37 ° C v aerobiozi 16 do 18 ur. Če gre za zahteven mikroorganizem, lahko zasluži mikroaerofilijo in če antibiogram vsebuje oksacilinske diske, ga je treba prebrati po 24 urah.

Za merjenje premera vsake halo se uporablja ravnilo. Rezultate je treba zabeležiti v mm. Naknadno se dobljene vrednosti uredijo s tabelami mejnih vrednosti, objavljenimi v trenutnem priročniku CLSI.

Merjenje halo inhibicije. Vir: USCDCP, Pixnio.com

Poročajte kot občutljivi (S), vmesni (I) ali odporni (R), odvisno od primera.

Antibiotiki so izbrani glede na izolirani mikroorganizem in vrsto okužbe, ki jo povzroča.

Včasih je treba upoštevati strateško umeščanje antibiotikov, da razkrijemo fenotipske vzorce odpornosti.

Strateška postavitev diskov na Müeller Hinton agar

Za enterobakterije je treba ploščo s klavulansko kislino postaviti proti cefalosporinom 3. in 4. generacije. Širitev v obliki jajčec kaže, da je sev proizvajalec betalaktamaz razširjenega spektra (ESBL). To pomeni, da bolnika ne smemo zdraviti s cefalosporini.

Fenotipska ekspresija produkcije beta-laktamaze s podaljšanim spektrom (ESBL) v sevu Escherichia coli. Vir: Fotografijo avtor mag. Marielsa gil

Pri stafilokoku je pomembno, da pred diskom s klindamicinom (D-test) postavimo disk z eritromicinom ali azitromicinom.

Odporen halo na eritromicinu in sploščenje halo klindamicina kažeta, da ima sev klindamicin, ki ga je mogoče inducirati s sevom (ICR). To pomeni, da zdravljenje s klindamicinom ne bo učinkovito.

Za iskanje inducibilnih sevov AMP C v Enterobacteriaceae in nekaterih ne-fermentirajočih Gram negativnih palicah, tazobaktanskih ceftazidimu, cefoksitinu ali piperacilinski diski so obrnjeni proti imipenem disku, na razdalji 27 mm.

Ploščen halo v enem od diskov, ki se soočajo z imipenemom, kaže na prisotnost inducibilne AMP C.

Za iskanje konstitutivnega C-AMP se 500 µg kloksacilinski disk spopada s ceftazidimom (30 µg) in cefotaksimom (30 µg) na razdalji 25 mm. Razširjena halo v katerem koli od cefalosporinov kaže na pozitivnost.

Cloxacillin disk lahko zamenjate tudi z 9 mm diskom filtrirnega papirja Whatman No. 6, impregniranega s fenil borovo kislino (400 µg) z razdaljo 18 mm. Razlaga se enako kot prejšnja.

Nazadnje, za raziskovanje proizvodnje metalobetalaktamaz, zlasti pri Pseudomonas aeruginosa, uporabimo disk, impregniran z 10 µl etilendiaminetetraocetne kisline (EDTA 750 µg) in tioglikolne kisline (SMA 300 µg), ki se sooča z imipenemom in meropenemskimi diski na razdalji 15 mm.

Preizkus je pozitiven, če se imipenem ali meropenem haloši širijo proti EDTA / SMA disku. Ta rezultat je treba potrditi s spremenjenim Hodge testom.

Ta metoda je sestavljena iz inokulacije seva Escherichia coli ATCC 25922 na ploščo Müeller Hinton. V sredini plošče je nameščen imipenemski disk in nato se od diska do oboda naredi trak z domnevnim sevom P. aeruginosa. Na ploščo je mogoče preskusiti do 4 seve.

Preizkus bo pozitiven, če bo okoli strij območje izkrivljanja imipenem halo.

Vzroki za napačne rezultate

- Slabo ohranjeni antibiotični diski lahko ustvarijo lažno odpornost. Na primer, oksacilinski disk je zelo občutljiv na temperaturne spremembe.

-PH pH medija pod navedenim (kiselim) povzroči manjše halogene aminoklikozide in makrolide (nevarnost lažne odpornosti), večje halo pa penicilin, tetraciklin in novobiocin (nevarnost lažne občutljivosti).

-Če je pH nad navedenim (alkalnim), so zgoraj opisani učinki obrnjeni.

-Medija z visokimi koncentracijami timina in timidina vpliva tako, da znatno zmanjša inhibicijske haloge sulfonamidov in trimetoprima.

-Visoke koncentracije kalcija in magnezija povzročajo lažno odpornost aminoglikozidov, polimiksina B in tetraciklin proti sevom Pseudomonas aeruginosa.

-Nizke koncentracije kalcija in magnezija povzročajo lažno občutljivost aminoglikozidov, polimiksina B in tetraciklin proti sevom Pseudomonas aeruginosa.

- Prisotnost cinka vpliva na rezultate diskov karbapenema (imipenem, meropenem in ertapenem).

-Debelina medija pod 3 mm bo dala lažne rezultate občutljivosti, debelina nad 5 pa lažno odpornost.

-Mobilizacija diskov v antibiogramu bo dala deformirane haloge, saj je sproščanje antibiotikov takojšnje.

- Zelo šibki inokulumi vplivajo na rezultate, ker ne bo prišlo do enakomerne ali sotočne rasti agarja, kar je nujen pogoj, da lahko merimo inhibicijske haloge, poleg dejstva, da lahko halosi dajo večje od običajnih.

-Preveč naložena inokula lahko povzroči haloge manjše od običajnih.

- Ne glede na razdaljo med diski se en halo prekriva z drugim in jih ni mogoče pravilno prebrati.

-Ikubiranje s CO ₂ poveča velikost haloa tetraciklinskih in meticilinskih diskov.

-Inkubiranje pri temperaturah pod 35 ° C povzroči večje haloge.

-Dodajanje krvi zmanjša velikost halogenida sulfa.

Omejitev

Občutljivost antibiotika, ki se pokaže v antibiogramu proti mikroorganizmu (in vitro), ni zagotovilo, da bo deloval in vivo.

QA

Če želite vedeti, če medij vsebuje zadostno količino timijana, je treba zasaditi sev Enterococcus faecalis ATCC 29212 in preizkusiti občutljivost na trimetoprim sulfametoksazol (SXT), da mora biti halo enak ali> 20 mm, da bo zadovoljiv.

Reference

1. "Müller-Hinton agar." Wikipedija, prosta enciklopedija. 16. november 2018, 12:23 UTC 27. januar 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Pogoji za dobro študijo občutljivosti z agar difuzijskim testom. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77–81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratorij. Müeller Hinton agar s 5% ovčje krvi. 2009. Dostopno na naslovu: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017. Dostopno na: .bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton agar. 2015. Dostopno na: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. betalaktamaze tipa AmpC: Splošnosti in metode za fenotipsko odkrivanje. Rev. Soc. Ven. Mikrobiol. 2009; 29 (2): 78–83. Dostopno na: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotipsko odkrivanje metalobetalaktamaz v kliničnih izolatih bakterije Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Dostopno na: scielo.org.