ZAPOREDJE DNK: MAXAM-GILBERT, METODA IN PRIMERI - BIOLOGIJA - 2026

Sekvenciranje DNK (deoksiribonukleinska kislina) je postopek laboratorijih za molekularno biologijo, ki omogoča , da vedo zaporedja nukleotidov v genetskem materialu nas zanima. Nadalje je mogoče razkriti tudi sekvenciranje RNA (ribonukleinska kislina).

Ta tehnika je bila nujno potrebna za razvoj bioloških znanosti. Uporablja se tudi za druga področja znanja - na primer medicinsko diagnozo in forenzične preiskave.

Vir: pixabay.com

Pred tem je bilo sekvenciranje verige DNA počasno in drago delovanje, ki je omogočilo identifikacijo le nekaj baznih parov v oligonukleotidih.

Danes je, z vsem napredkom znanosti, sekvenciranje DNK rutinska operacija v mnogih laboratorijih po vsem svetu, zahvaljujoč prispevanju skoraj 50 let raziskav na tem področju. Glede na dolžino verige lahko v zelo kratkem času zaporedimo do milijone baznih parov.

Da bi to naredili, obstaja na desetine razvitih tehnik, ki se razlikujejo po ceni in natančnosti. V tem članku bomo opisali tako klasične kot sodobne tehnike, vsaka s svojimi prednostmi in slabostmi.

Do sedaj tehnike sekvenciranja omogočajo pridobivanje zaporedja celotnih genomov, od majhnih prokariotov in kvasovk do človeškega genoma.

Struktura DNK

Za razumevanje metod in tehnik, ki se uporabljajo za zaporedje DNK, je treba poznati nekatere ključne vidike strukture in sestave molekule.

DNK je biomolekula, ki jo najdemo v vsem živem, od bakterij do velikih vodnih živali. Organele - kot mitohondriji in kloroplasti - imajo v sebi krožno molekulo DNK. Celo pri nekaterih virusih najdemo genetski material DNK.

Strukturno je DNK zbirka nukleotidov. Vsak je sestavljen iz ogljikovih hidratov, dušikove baze (A, T, C ali G) in fosfatne skupine. Cilj sekvenciranja DNK je razkriti vrstni red, v katerem se v zaporedju najdejo štiri dušikove baze.

Zgodovina

Sredi petdesetih let sta raziskovalca Watson in Crick opisala strukturo DNK s pomočjo kristolografskih tehnik. Vendar pa noben od teh raziskovalcev ni mogel najti načina, kako bi razkril zaporedje.

Čeprav so bili določeni predhodniki, je bil najpomembnejši dogodek ustvarjanje metode Sanger, leta 1977. Frederick Sanger, oče metode, je bil britanski biokemik, dobitnik dveh Nobelovih nagrad za svoje ogromne prispevke k biološkim znanostim.

Ta tehnika je v literaturi znana tudi kot "prekinitev verige" ali dideoksinukleotidi. Načela te tehnike in načela, ki so bila razvita na podlagi njenega izboljšanja in inovativnosti, bodo opisana spodaj.

Sanger metoda

Razvoj metode Sanger je predstavljal ključni dogodek v molekularni biologiji. Vključuje osnovne sestavine procesa podvajanja DNK, ki se običajno pojavljajo v celici, vendar doda posebno komponento: dideoksinukleotidi.

Glavne komponente reakcije

- DNK polimeraza: Encim polimeraza DNK je ključni element postopka. Ta molekula sodeluje pri razmnoževanju verige DNA, njena vloga pa je sinteza novega sklopa, pri čemer se trifosfatni deoksiribonukleotidi povežejo s komplementarnimi.

Spomnimo se, da se v DNK timini (T) parijo z adenini (A) skozi dve vodikovi vezi, medtem ko citozin (C) to počne z gvaninom (G) skozi tri vezi.

- Nukleotidi: Sangerno sekvenciranje vključuje dve vrsti nukleotidov, štiri 2'-deoksinnukleotide (okrajšano kot dATP, dGTP, dCTP in dTTP) in štiri dideoksinukleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP in ddTTP).

Čeprav so dideoksinukleotidi podobni monomerom, ki so običajno vgrajeni v DNK, nimajo v svoji strukturi skupine -OH. To onemogoča dodajanje novega nukleotida v verigo.

Ko se torej verigi v nastajanju doda poseben nukleotid - na povsem naključen način - se sinteza ohromi. Tako na koncu reakcije obstajajo verige različnih velikosti, vsaka, kjer je bila reakcija ustavljena na drugačni točki.

Eksperimentalno so pripravljeni štirje testi. Vsaka vsebuje DNK, izvlečen iz zanimivega biološkega vzorca, normalne nukleotide in enega od štirih posebnih vrst nukleotidov. Bodisi posebni nukleotidi so označeni z neko vrsto fluorescentnega markerja (glejte avtomatizirano zaporedje spodaj).

Branje rezultatov

Prvi korak je ločitev vsake od sintetiziranih verig glede na njihovo velikost. Nekatere bodo daljše od drugih, odvisno od tega, kje so bile vgrajene posebne podlage.

Obstajajo različne biokemijske tehnike, ki omogočajo ločevanje sestavin zmesi z uporabo velikosti kot diskriminatorne lastnosti. Pri Sangerjevi metodi so različne verige ločene z elektroforezo. V bolj izpopolnjenih različicah tehnike se uporablja kapilarna elektroforeza.

Tako daljši prameni potujejo manj od krajših različic. Ta sistem nato preide skozi bralnik, ki prepozna označevalec, ki je vključen v vsak dideoksinukleotid. Na ta način je mogoče poznati vrstni red zaporedja.

Ta "prva generacija" tehnika lahko odčita fragmente DNK, ki ne presegajo 1 kilobaze. Trenutno se metoda Sanger uporablja v različnih laboratorijih, na splošno v sodobnih različicah. Poleg tega se uporablja za potrditev rezultatov, pridobljenih z najkompleksnejšimi tehnikami - vendar manj natančnimi.

Samodejno zaporedje

Kadar je potrebno zaporedje v velikem obsegu, se postopek pospeši z avtomatizacijo. To je različica metode zaključka verige Sanger, kjer so temeljni premazi označeni s fluorescentnimi izdelki, da bi jih razlikovali.

Nato se reakcijski produkt izvaja v elektroforezi - vse na enem pasu. Ko vsak fragment izstopi iz končnega dela gela, ga hitro prepoznamo po fluorescentnem označevanju, z napako okoli 1%.

Najbolj izpopolnjeni sistemi imajo sistem do 96 kapilarnih cevi, ki jih upravlja računalnik, povezan z robotom. To pomeni, da lahko hkrati testiramo 96 vzorcev DNK. Tako je postopek, ki vključuje elektroforezo in analizo rezultatov, popolnoma avtomatiziran.

V enem dnevu lahko ti sistemi zaporedjo do 550 000 baz. Med postopkom je človeško delo nepotrebno, za začetek metode potrebuje le približno 15 minut.

Maxam-Gilbert zaporedje

Hkrati, ko je Sanger objavil svoje delo, sta dva raziskovalca z imenom Allan Maxan in Walter Gilbert uspela razviti drugo metodo, da bi pridobila zaporedje DNK. Metoda je takrat pridobila na popularnosti, a jo je kasneje izpodrinilo izboljšanje Sangerjeve metode.

V nasprotju s Sangerjevo metodo sekvenciranje Maxana in Gilberta (ali kemično sekvenciranje, kot je tudi znano) ne vključuje reakcij hibridizacije. Metodologija je sestavljena iz označevanja z reaktivnimi sredstvi na enem koncu, čemur sledi postopek čiščenja.

Eden od negativnih vidikov te tehnike je v njeni ogromni zapletenosti in uporabi kemikalij, ki so nevarne za uporabnika. Kemični zlomi se sprožijo z uporabo DMS, mravljinčne kisline, hidrazina in hidrazina s solmi.

Proces

Protokol se začne z označevanjem na 5 'koncu pramena z fosforjevim markerjem 32, nato pride do kemične spremembe dušikove baze in se loči. Končno pride do cepitve abasične regije.

Najprej skratite niz, ki ga želite zaporediti na manjše segmente. Ta korak se izvaja z restrikcijskimi encimi, ki imajo za posledico štrleče konce.

Nato reakcijo izvedemo z alkalno fosfatazo, katere namen je odstranitev fosfatne skupine. Tako lahko za izvajanje označevanja uporabimo polinukleotidno kinazo.

Veriga je denaturirana (odprta dva pramena). Nato se nanesejo kemikalije. Te reakcije cepitve potekajo kontrolirano in znano je, na katere vrste vezi se vsaka kemična pretrga.

Branje rezultatov

Kot pri metodi Sanger tudi branje rezultatov vključuje ločitev verig, pridobljenih v sistemu elektroforeze, po velikosti. Sistemi, sestavljeni iz poliakrilamida, omogočajo, da dobimo zelo dobro ločljivost za branje gela.

Množično zaporedje

Množično zaporedje zajema vrsto novih metod, okrajšanih kot NGS, iz angleščine "Next Generation Sequencing".

Metode, razvrščene kot NGS, zahtevajo predhodni korak amplifikacije DNA (ne delujejo z eno samo molekulo). Poleg tega se uporabljene platforme zelo razlikujejo. Spodaj bodo opisana načela najbolj priljubljenih metod:

Pirotekanje

Vključuje spremljanje sproščanja pirofosfata, ki se pojavi vsakič, ko se v verigo DNA doda nov nukleotid. Sistem encimov je povezan, tako da se emisija svetlobe (ki jo zazna kamera) pojavi vsakič, ko je vgrajen nov nukleotid.

Postopek se začne z ločeno inkubacijo vsake dušikove baze, da se preveri, ali obstaja svetloba. Piroaktiva lahko bere dolge nize, vendar je ugotovljena stopnja napake visoka.

Sintezno zaporedje

To vključuje vključitev označenih nukleotidov. Te fluorescentne komponente dodamo, izperemo in opazimo vgrajeni nukleotid. Nato se nukleotidna nalepka odstrani in sinteza pramena se lahko nadaljuje. V naslednjem koraku bo vključen tudi označeni nukleotid in ponovljeni koraki se bodo ponovili.

Pomanjkljivost te tehnike se pojavi, kadar fluorescenčni markerji niso popolnoma odstranjeni. Te emisije ustvarjajo napake v ozadju, kar povzroči znatne napake.

Zaporedje ligacij

Ta tehnika se razlikuje od drugih, saj ne uporablja DNK polimeraze. Namesto tega je ključni encim za to metodologijo ligaza. Tukaj se uporabljajo fluorescentno označeni fragmenti DNK, jih povezuje encim in ga zaznamo.

Največja težava te tehnike je kratka dolžina fragmenta, ki jo je mogoče obdelati.

Ionsko sekvenca hudournikov

Ta tehnika temelji na merjenju iona H ^+, ki se sprosti ob vgradnji novega nukleotida. Načelo je precej podobno pirosekciji, vendar precej cenejše.

Primeri

Zaporedje človeškega genoma

Sekvenciranje človeškega genoma je bil eden najbolj obetavnih izzivov v biologiji, pa tudi eno najbolj cenjenih tekem v zgodovini znanosti. Pravzaprav je za znanstvenike, ki sodelujejo v projektu, sekvenciranje genoma postalo konkurenca.

Leta 1990 je začel z imenom "projekt človeškega genoma", ki ga je vodil znani znanstvenik, dobitnik Nobelove nagrade James Watson. Po enem letu, leta 1991, Venter prevzame izziv "pretepati" Watsona in zaporediti genom pred njim. Vendar se je leta 1992 Watson upokojil in ukaz je prevzel drug raziskovalec.

Leta 1995 je Venter razglasil svoj uspeh pri popolnem sekvenciranju bakterijskega genoma po metodi naključnega sekvenciranja. Prav tako je nasprotna ekipa leto pozneje napovedala sekvenciranje genskega kvasa.

Leta 2000 je diplomo ukinila. Obe podjetji sta objavili svoje predhodne rezultate celotnega genoma v dveh najprestižnejših znanstvenih revijah Nature in Science.

Vendar so znanstveniki še naprej delali na izboljšanju predlogov in leta 2006 so bili končani zaporedji nekaterih človeških kromosomov.

Pomen in aplikacije

Poznavanje vrstnega reda nukleotidov tako pomembne molekule, kot je DNK, je koristno za biologe in z njimi povezane strokovnjake. Ta veriga polinukleotidov vsebuje vse informacije, potrebne za razvoj in vzdrževanje vseh oblik življenja.

Zaradi tega je poznavanje tega zaporedja bistveno za biološke raziskave. V osnovi zaporedje omogoča merjenje ene najpomembnejših lastnosti bioloških sistemov in ugotavljanje razlik med njimi.

Sekvenciranje pogosto uporabljajo taksonomisti in sistematiki, saj nekatere sekvence DNK omogočajo določitev meril za sklep, ali dva organizma pripadata isti vrsti ali ne, poleg tega pa lahko predlagata hipoteze o filogenetskih razmerjih med njimi.

Poleg tega ima DNK sekvenciranje uporabo v medicini in diagnostiki. Na primer, obstajajo poceni in dostopni sistemi, ki s pomočjo zaporedja omogočajo oceno nagnjenosti k razvoju določenih bolezni (kot je rak) z uporabo tako imenovanih polimorfizmov z enim nukleotidom (SNP).

Preiskave kriminalistične in forenzične vrste so bile obogatene tudi s tehnikami zaporedja, ki jih lahko uporabimo kot zanesljiv dokaz udeležbe določenega posameznika v kaznivem dejanju.

Reference

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Zaporedje sekvencerjev: zgodovina sekvenciranja DNA. Genomics, 107 (1), 1–8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Naslednja generacija zaporedne revolucije in njen vpliv na genomiko. Celica, 155 (1), 27–38.
3. Levy, J. (2010). Znanstvena rivalstva. Od Galileja do projekta človeškega genoma. Uredništvo Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, AR (1977). Sekvenciranje DNK z zaviralci verige. Zbornik Nacionalne akademije znanosti, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Sekvenca naslednje generacije preoblikuje današnjo biologijo. Naravne metode, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (ur.). (2014). Naslednja generacija sekvenciranja Caister Academic Press.