OKSIDAZNI TEST: UTEMELJITEV, POSTOPEK IN UPORABE - BIOLOGIJA - 2026

Test oksidaze je diagnostična metoda, ki pokaže prisotnost encimskega kompleksa, imenovanega citokrom oksidaza c. Ta sistem povzroči pretvorbo citokroma, reduciranega v oksidirano, saj ta zajame kisik, kar pa je zadnji akceptor elektrona (H ⁺ ) v dihalni verigi.

Izraz oksidaza je kratek način, ki se nanaša na encim citokrom oksidazo, znan tudi kot indofenol oksidaza. V starih časih je veljalo, da sta encima citokromoksidaza in indofenol oksidaza dva različna encima, danes pa je znano, da sta enaka.

Pozitivni in negativni test oksidaze. Vir: Avtor ni na voljo za branje avtorja. Predpostavljeni Alpha.prim ~ commonswiki (na podlagi trditev o avtorskih pravicah).

Citohromi so hemoproteini, ki vsebujejo železo in dokončajo sistem citokrom oksidaze. Citohromi se lahko razlikujejo od vrste do vrste.

Obstajajo različne sorte citokromov (citokromi a1, a2, a3 in 0). Nekatere bakterije lahko proizvedejo samo eno, druge pa največ dve ali tri hkrati. V tem smislu je prisotnost citokroma a in a3 znana kot citokrom oksidaza c. To je vrsta citokroma, ki jo zazna preskus oksidaze.

Rodi Neisseria in Pseudomonas vsebujejo citokrom oksidazo c. Ti rodovi dajejo pozitiven test oksidaze, kar jim pomaga razlikovati od rodov Acinetobacter in Stenotrophomonas.

Obstajajo tudi drugi rodovi, ki so pozitivni na oksidazo.

Osnove

Značilnosti sistema citokrom oksidaze c

Sistem citokrom oksidaze c deluje na naslednji način: mikroorganizmi, pozitivni na oksidazo, uporabljajo kisik za ustvarjanje energije z aerobnim dihanjem. Ta sistem deluje zahvaljujoč transportu elektronov od snovi darovalk, kot je NADH ⁺ do receptorskih snovi, v tem primeru kisika.

Posledica tega je proizvodnja energije (ATP) in vode ali vodikovega peroksida, odvisno od sistema citokrom oksidaze, ki ga ima mikroorganizem.

Zato je večina oksidazno pozitivnih bakterij tudi katalazno pozitivnih, kar je nujen pogoj za odpravo nastalega vodikovega peroksida, saj je ta snov strupena za bakterije.

Sistem citokrom oksidaze c je prisoten v nekaterih aerobnih bakterijah, nekaterih fakultativnih anaerobih, nekaj mikroaerofičnih in brez strogih anaerobov. Slednje je razumljivo, saj strogi anaerobi ne morejo živeti v prisotnosti kisika, zato jim primanjkuje sistema citokrom oksidaze.

Načelo preizkusa

V tem testu uporablja snovi, ki delujejo kot umetni sprejemalci elektronov in nadomeščajo naravne v verigi prenosa elektronov.

V glavnem se uporabljajo barvila, kot so parafenilendiamin in indofenol, ki delujejo kot substrati receptorjev in umetni darovalci elektronov.

Parafenilendiamin oksidira s sistemom citokrom oksidaze c. Barvilo v zmanjšani obliki je brezbarvno, v oksidirani obliki pa barvno.

Tako je dokazano prisotnost sistema citokrom oksidaze c; ker bo pozitivna reakcija ustvarila sivko ali modro-vijolično barvo, odvisno od uporabljenega reagenta.

Po drugi strani pa, če je zadnja snov, ki sprejema elektrone, v dihalni verigi drugačna od kisika, bo oksidazni test negativen (barvne proizvodnje ni); to velja za anaerobne mikroorganizme.

Če se citokrom, ki ga uporablja mikroorganizem, razlikuje od citokrom oksidaze c, bo dal tudi negativni test.

Proces

Za preskus oksidaze obstajajo različni reagenti in protokoli, vsi z istim namenom.

Reagenti

Kovacsov reagent, Gordon in McLeod reagent, Nadi reagent, Carpenter, Suhrland in Morrison reagent ter uporaba oksidantnih diskov.

-Kovacs oksidazni reagent

Sestavljen je iz 1% tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorida.

Kovacsov reagent pripravimo z raztapljanjem 1 g zgoraj omenjene snovi v 50 ml destilirane vode. Subtilno segrevamo, dokler se popolnoma ne raztopi. Prenesite v jantarno steklenico z zadostno prostornino in dopolnite prostornino do 100 ml z destilirano vodo. Pred uporabo počakajte vsaj 15 minut. Shranjujte v hladilniku, zaščiteno pred svetlobo.

Označen je z reagentom Kovacsove oksidaze, da ga ločimo od Kovacsovega reagenta, ki se uporablja za razkrivanje indolovega testa. Ta reagent je najbolj občutljiv, manj strupen, vendar dražji od preostalih reagentov.

Pozitivna reakcija se bo pokazala s tem reagentom s spremembo barve kolonije v sivko, ki se hitro spremeni v vijolično skoraj črno. Negativna reakcija je očitna, ker v koloniji ni barvne spremembe ali pa prevzame rahlo rožnato barvo. Tudi medij lahko potemni, vendar to ne pomeni pozitivne reakcije.

Pri tem reagentu je reakcijski čas ključen, sprememba barve, ki se pojavi med 5 do 15 sekund, se šteje za pozitivno reakcijo.

-Gordon in McLeod reagenti

Sestavljen je iz dimetil-p-fenilendiamin dihidroklorida, znan tudi kot N-dimetil-p-fenilendiamin ali p-aminodimetilanilin monohidroklorid. Pripravljen je tako, kot je opisano za reagent Kovacs oksidaze, ki nadomešča zadevno snov.

Ta reagent je nekoliko bolj stabilen kot reagent Kovacs oksidaze, čeprav so vsi reagenti, ki vsebujejo p-fenilendiamin, nestabilni.

Ta reakcija je poznejša, razlaga se kot pozitivna s pojavom modro-vijolične barve v 10 do 30 minutah.

-Nad reagent

Sestavljen je iz 1% α-naftola v etilnem alkoholu (95% etanola) in 1% aminodimetilanilina. Zmes pripravimo v enakih delih in z uporabo absolutnega etilnega alkohola uporabljamo kot razredčilo, dokler ne pripravimo zadostne količine za 100 ml.

- reagenti Carpenter, Suhrland in Morrison

Sestavljen je iz 1% p-aminodimetilalanin oksalata. Pripravite na enak način, kot je opisano za reagent Kovacs oksidaze, pri čemer spremenite za ustrezno snov.

S pripravljeno raztopino se pripravijo testni trakovi na naslednji način: 6-8 cm trakovi filtrirnega papirja Whatman št. 1 so impregnirani z 1% reagentom dimetil-p-fenilendiamin oksalata.

Lahko se posušijo brez stika s kovino, shranjujejo v posodice z vijaki z sušilnim sredstvom in shranjujejo v hladilniku. Ti trakovi so stabilni do 6 mesecev.

Je najbolj stabilen reagent od vseh omenjenih in v raztopini lahko traja do 6 mesecev. Druga plus točka je, da ne obarva medija okoli kolonije, če se uporablja neposredno na plošči.

Videz rdeče barve se razlaga kot pozitiven test.

-Oksidazni diski

Gre za komercialne diske, ki so impregnirani z reagentom za test oksidaze. Na trgu je več komercialnih znamk.

Njegova uporaba je povsem praktična, saj ni potrebno pripraviti svežih reagentov, kar olajša delo. Dobljeni rezultati so zanesljivi, če so diski pravilno ohranjeni.

Protokoli

Metoda neposredne plošče, posredna metoda na papirju in uporaba diskov, impregniranih z oksidaznimi reagenti.

- Metoda neposredne plošče

2 ali 3 kapljice katerega koli od zgoraj omenjenih reagentov se dodajo v ta namen neposredno na kolonijo (-e), vsebovano v plošči s kulturnim gojiščem, ki ne vsebuje glukoze.

Spremeni se ali spremeni barva kolonij ali ne, medij pa ne. Veljavni reakcijski čas je odvisen od uporabljenega reagenta.

-Neposredna metoda na papirju

Odrežite kos filtrirnega papirja (Whatman št. 1) na velikost 6 cm ² in ga položite v prazno petrijevo posodo.

Na papir dodamo 2 ali 3 kapljice reagenta Kovacs oksidaze, del kolonije, ki jo preiskujemo, s platinastim ročajem ali lesenim zobotrebcem in ga v ravni črti razporedimo na impregniran papir. Razlaga v 5 do 10 sekundah.

S trakovi, pripravljenimi z reagentom Carpenter, Suhrland in Morrison, se na suhem traku razširi kolonija. Za testiranje več sevov se uporablja en sam trak. Razlaga v 10 sek.

-Diski (m

Tržne diske navlažite s sterilno destilirano vodo in nanesite na kolonijo, ki jo je treba preučiti. Priporočljivo je, da plošče uporabljate pri 35 ° C, če uporabljate plošče pri sobni temperaturi ali hladilne plošče, je reakcija nekoliko počasnejša. Razlago spremembe barve razlagajte med 10 in 20 sek.

Uporabiti je mogoče kolonije v krvi ali čokoladnem agarju.

-Diski (posredna metoda)

Navlažite disk, kot je opisano prej. Položite ga v prazno Petrijevo posodo. Vzemite zadostno količino kolonije za študij s platinskim ročajem ali lesenim zobotrebcem in položite na disk. Razlago spremembe barve razlagajte med 10 in 20 sek.

Uporaba

Rodi Neisseria in Acinetobacter sta včasih morfološko zelo podobni, ker čeprav je rod Acinetobacter gramo-negativna palica, lahko včasih dobi kokkoidno obliko in se porazdeli v parih, kar simulira rod Neisseria.

V tem primeru je test oksidaze resnično koristen. Rod Neisseria je pozitiven, Acinetobacter negativen.

Vendar je rod Moraxella zelo podoben rodu Neisseria in oba dajeta pozitivno reakcijo; Zato je treba za dokončno identifikacijo vedno izvajati fermentacije ogljikovih hidratov.

Po drugi strani je test oksidaze koristen za razlikovanje bakterije iz družine Enterobacteriaceae (vsa negativna na oksidazo) od drugih fermentorjev, kot so rod Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (pozitiven na oksidazo).

Rodi Vibrio in Helicobacter sta tudi oksidazno pozitivni.

QA

Uporabite znane seve bakterije Escherichia coli kot negativno kontrolo, vrste Pseudomonas aeruginosa pa kot pozitivno kontrolo.

Omejitve

-Ragenti se morajo uporabljati sveže pripravljeni, njihov rok uporabe v raztopini pri sobni temperaturi je kratek, ker so zelo nestabilni. Hlajeni lahko trajajo od 5 dni do 2 tedna.

-Ragenti so brezbarvni, če spremenijo barvo, jih je treba zavreči. Poškodovani diski se pokažejo, ker sčasoma potemnijo.

-Pozitivna reakcija z reagentom Kovacsove oksidaze med 15-60 sec velja za zapoznjeno reakcijo, po 60 sekundah pa jo je treba šteti za negativno.

-Haemophylus influenzae daje negativno oksidazno reakcijo, če uporabimo reagent z dimetil-p-fenilendiaminom, vendar pozitivno, če uporabimo reagent Kovacs oksidaze (tetrametil-p-fenilendiamin).

-Mediji, ki vsebujejo glukozo, motijo ​​test, kar daje lažne negativne učinke.

-Bordetella oslovski pertusisi lahko povzročijo lažno pozitivno reakcijo, če prihajajo iz visoko koncentriranih plošč s krvnim agarjem.

-Uporaba kovinskih (železnih) ročajev daje lažno pozitivno reakcijo.

priporočila

-Ker so reagenti zelo nestabilni in nagibajo k samooksidiranju, priporočamo, da alikvote od 1 do 2 ml zamrznete in jih po potrebi odstranite.

-Drug način za zamudo avtooksidacije reagenta je dodajanje 0,1% askorbinske kisline pri pripravi reagentov.

-Ker so reagenti nestabilni, je priporočljivo preverjati kakovost tedensko.

-Ragenti, ki ne opravijo preskusa kakovosti, se ne smejo uporabljati.

Reference

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
3. "Test oksidaze." Wikipedija, prosta enciklopedija. 15. januar 2018, 10:32 UTC 3. april 2019, 14:03
4. Svetovna zdravstvena organizacija. Laboratorijski priročnik za identifikacijo in testiranje občutljivosti na protimikrobna zdravila za bakterijske patogene pomembnosti za javno zdravje v razvoju v svetu. 2004. Dostopno na naslovu: who.int/drugresistance/infosharing
5. Trakovi z reagenti za diagnozo aktivnosti oksidaze pri bakterijah. Rev Kubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150–151.