CITOKEMIJA: ZGODOVINA, PREDMET PROUČEVANJA, UPORABNOST IN TEHNIKE - BIOLOGIJA - 2026

Citokemiji obsega vrsto tehnik, ki temeljijo na identifikaciji in razporeditvi določenih snovi znotraj celice. Velja za vejo celične biologije, ki združuje celično morfologijo s kemijsko strukturo.

Po besedah ​​Bensleyja, ustanovitelja aplikacije moderne citologije, je izraženo, da je namen citokemije odkriti kemično organizacijo celic, da bi razumeli skrivnosti življenja. Kot tudi preučevanje dinamičnih sprememb, ki se pojavijo med različnimi funkcionalnimi fazami.

1: Pagetova dodatna bolezen. (Hematoksilin-Eozin) 2: senilni plaki, opaženi v možganski skorji pri bolniku z Alzheimerjevo boleznijo. (Srebrna impregnacija) 3: Kunčji jezik, Kolagenska vlakna (modra). Mišična vlakna (vijolični trakovi). (Massonov trihrom). 4: Jetrno tkivo z maščobno degeneracijo. (Sudan III) 5: Vneta jetra. Nekroza. Viri: Wikipedija. com / Uporabnik: KGH / Datoteke javnih domen / Mohit Lalwani

Na ta način je mogoče določiti presnovno vlogo teh snovi v celici.

Citokemija uporablja dve glavni metodi. Prva temelji na kemijskih in fizikalnih postopkih. Te tehnike se zatekajo k uporabi mikroskopa kot nepogrešljivega instrumenta za vizualizacijo kemijskih reakcij, ki se dogajajo na določenih snoveh v celici.

Primer: uporaba citokemijskih barvil, kot sta Feulgenova reakcija ali reakcija PAS, med drugim.

Druga metoda temelji na biokemiji in mikrokemiji. S to metodologijo je mogoče količinsko določiti prisotnost medceličnih kemikalij.

Med snovmi, ki se lahko razkrijejo v strukturi tkiva ali celice, so naslednje: beljakovine, nukleinske kisline, polisaharidi in lipidi.

Zgodovina citokemije

Citokemijske tehnike od njihovega izuma pomagajo razumeti sestavo celic, sčasoma pa so se pojavile različne tehnike, ki uporabljajo različne vrste barvil z različnimi afinitetami in osnovami.

Nato je citokemija odprla nova obzorja z uporabo nekaterih substratov, da bi kolorimetrično prikazala prisotnost encimov ali drugih molekul v celici.

Prav tako so se pojavile druge tehnike, kot je imunocitokemija, ki so bile v veliko pomoč pri diagnozi številnih bolezni. Imunocitokemija temelji na reakcijah antigen-protitelo.

Po drugi strani je citokemija uporabljala tudi fluorescenčne snovi, imenovane fluorokromi, ki so odlični markerji za odkrivanje določenih celičnih struktur. Zaradi značilnosti fluorokroma poudarja strukture, na katere je bil pritrjen.

Kaj študiraš?

Različne citokemijske tehnike, ki se uporabljajo na biološkem vzorcu, imajo nekaj skupnega: razkrijejo prisotnost posebne vrste snovi in ​​poznajo njeno lokacijo v ocenjeni biološki strukturi, naj bo to celica ali tkivo.

Te snovi so lahko encimi, težke kovine, lipidi, glikogen in določene kemične skupine (aldehidi, tirozin itd.).

Informacije, ki jih zagotavljajo te tehnike, lahko dajo smernice ne samo za identifikacijo celic, ampak tudi za diagnozo različnih patologij.

Na primer, citokemični madeži so zelo koristni pri razlikovanju med različnimi vrstami levkemije, saj nekatere celice izražajo nekatere encime ali ključne snovi, druge pa ne.

Po drugi strani je treba opozoriti, da je za uporabo citokemije treba upoštevati naslednje:

1) Snov je treba imobilizirati na mestu, kjer je naravno.

2) Snov je treba identificirati s substrati, ki reagirajo posebej z njo in ne z drugimi spojinami.

Uporabnost

Vzorci, ki jih je mogoče proučiti s pomočjo citokemičnih tehnik, so:

- razširjena periferna kri.

- razširjen kostni mozeg.

- Tkiva, pritrjena na histokemijske tehnike.

- Celice, fiksirane s citocentrifugiranjem.

Citokemijske tehnike so na področju hematologije zelo podprte, saj jih pogosto uporabljamo pri diagnozi in diferenciaciji nekaterih vrst levkemije.

Na primer: Esterazne reakcije se uporabljajo za razlikovanje mielomonocitne levkemije od akutne monocitne levkemije.

Odmevi kostnega mozga in periferne krvi pri teh bolnikih so podobni, saj je nekatere celice težko morfološko prepoznati same. Za to se opravi test esteraze.

V prvem so specifične esteraze pozitivne, v drugem pa nespecifične.

Zelo uporabni so tudi v histologiji, saj na primer uporaba tehnike obarvanja s težkimi kovinami (impregnacija s srebrom) obarva retikularna vlakna intenzivne rjave barve v miokardnem tkivu.

Tehnike citokemije

Spodaj bodo opisane najpogosteje uporabljene tehnike:

- Uporaba barvil

Uporabljeni madeži so v citokemijskih tehnikah zelo raznoliki in jih je mogoče razvrstiti glede na več vidikov:

Glede na radikal, s katerim imajo afiniteto

Delimo jih na: kisle, bazične ali nevtralne. So najpreprostejši in najbolj uporabljeni v zgodovini, kar nam omogoča, da ločimo bazofilne sestavine od acidofilnih. Primer: obarvanje s hematoksilinom in eozinom.

V tem primeru jedra celic obarvajo modro (jemljejo hematokslin, ki je osnovni madež), citoplazme pa rdeče (jemljejo eozin, kar je kisli madež).

Glede na barvo, ki jo zagotavljajo

Lahko so ortohromatski ali metahromatski. Ortohromatika je tista, ki obarva strukture iste barve, kot jo ima barvilo. Na primer primer eozina, katerega barva je rdeča in obarva rdeče.

Po drugi strani pa metahromatika obarva strukture drugačne barve kot njihove, na primer toluidin, katerega barva je modra in še obarva vijolično.

Vitalna ali supravitalna barvila

So neškodljiva barvila, torej barvajo celice in ostanejo žive. Te madeže imenujemo vitalne (npr. Poskusno modro za obarvanje makrofagov) ali supravitalne (npr. Janusova zelena za obarvanje mitohondrijev ali nevtralno rdeča za obarvanje lizosomov).

- Zaznavanje lipidov z barvili, topnimi v maščobi

Osmijev tetroksid

Obarva lipide (nenasičene maščobne kisline) črne. To reakcijo lahko opazujemo s svetlobnim mikroskopom, a ker je to barvilo visoke gostote, ga je mogoče vizualizirati tudi z elektronskim mikroskopom.

Sudan III

Je ena izmed najbolj uporabljanih. To barvilo se razprši in solubilizira v tkivih, nabira pa se znotraj lipidnih kapljic. Barva je škrlatno rdeča.

Sudanski črni madež B

Ustvari boljši kontrast kot prejšnji, ker se lahko raztopi tudi v fosfolipidih in holesterolu. Uporaben je za odkrivanje azurofilnih in specifičnih zrnc zrelih granulocitov in njihovih predhodnikov. Zato prepoznava mieloidne levkemije.

- Obarvanje z aldehidno skupino (periodična kislina Schiff madež)

Periodna kislina Schiffov madež lahko zazna tri vrste aldehidnih skupin. To so:

- Prosti aldehidi, ki so naravno prisotni v tkivih (plazemska reakcija).

- Aldehidi, pridobljeni s selektivno oksidacijo (reakcija PAS).

- Aldehidi, pridobljeni s selektivno hidrolizo (Feulgenska reakcija).

PAS reakcija

To obarvanje temelji na odkrivanju nekaterih vrst ogljikovih hidratov, na primer glikogena. Periodna kislina Schiff prekine CC vezi ogljikovih hidratov zaradi oksidacije glikolnih skupin 1-2 in tako sprosti aldehidne skupine.

Proste aldehidne skupine reagirajo s Schiffovim reagentom in tvorijo vijolično-rdečo spojino. Videz vijolično-rdeče barve kaže pozitivno reakcijo.

Ta test je pozitiven v rastlinskih celicah, odkrivanje škroba, celuloze, hemiceluloze in peptinov. Medtem ko v živalskih celicah zazna mucine, mukoproteine, hialuronsko kislino in hitin.

Poleg tega je med drugimi patologijami mielodisplastičnega tipa koristna pri diagnozi limfoblastičnih levkemij ali eritrolevkemije.

V primeru kislih ogljikovih hidratov lahko uporabimo alkijsko modri madež. Test je pozitiven, če opazimo svetlo modro / turkizno barvo.

Plazemska reakcija

Reakcija v plazmi razkriva prisotnost nekaterih dolgo verižnih alifatskih aldehidov, kot sta palma in stearal. Ta tehnika se uporablja na zamrznjenih histoloških odsekih. Zdravi se neposredno s Schiffovim reagentom.

Feulgenska reakcija

Ta tehnika zazna prisotnost DNK. Tehnika je sestavljena iz izpostavljenosti fiksiranega tkiva hidrolizi šibke kisline, da se kasneje reagira s Schiffovim reagentom.

Hidroliza izpostavlja deoksiribozni aldehidni skupini na povezavi deoksiriboza-purin. Schiffov reagent nato reagira z aldehidnimi skupinami, ki so ostale proste.

Ta reakcija je pozitivna v jedrih in negativna v citoplazmah celic. Pozitivnost dokazuje prisotnost rdeče barve.

Če to tehniko kombiniramo z metilno-zelenim pironinom, je mogoče istočasno zaznati DNK in RNK.

- Citokemični madeži za beljakovinske strukture

Za to lahko uporabimo Millonovo reakcijo, ki kot reagent uporablja živosrebrni nitrat. Strukture, ki vsebujejo aromatične aminokisline, bodo obarvale rdeče.

- Citokemični madeži, ki uporabljajo podlage za dokazovanje prisotnosti encimov

Ti madeži temeljijo na inkubiranju biološkega vzorca z določenim substratom in reakcijski produkt nato reagira z diazo solmi, da tvori obarvan kompleks.

Esteraze

Ti encimi so prisotni v lizosomih nekaterih krvnih celic in so sposobni hidrolizirati organske estre, ki sproščajo naftil. Slednji tvori netopno azo barvilo, ko se veže na diazo sol, obarva mesto, kjer se reakcija pojavi.

Obstaja več substratov, odvisno od tega, kateri uporabimo, lahko določimo posebne esteraze in nespecifične esteraze. Prve so prisotne v nezrelih celicah mieloidne serije, druge pa v celicah monocitnega izvora.

Substrat, ki se uporablja za določanje specifičnih esteraz, je: naftol-AS-D kloroacetat. Medtem ko lahko za določitev nespecifičnih esteraz uporabimo več substratov, kot so naftalin AS-D acetat, alfa naftil acetat in alfa naftil butirat.

V obeh primerih se celice obarvajo temno rdeče, ko je reakcija pozitivna.

Mieloperoksidaza

Ta encim najdemo v azurofilnih zrnih granulocitnih celic in monocitov.

Njeno odkrivanje se uporablja za razlikovanje levkemij mieloidnega izvora od limfoidnih. Celice, ki vsebujejo mieloperoksidaze, postanejo oker rumene.

Fosfataze

Ti encimi sproščajo fosforne kisline iz različnih substratov. Med seboj se razlikujejo glede na specifičnost podlage, pH in delovanje zaviralcev in inaktivatorjev.

Med najbolj znanimi so fosfomonoesteraze, ki hidrolizirajo preproste estre (PO). Primer: alkalna fosfataza in kisla fosfataza, pa tudi fosfamidaze, ki hidrolizirajo vezi (PN). Uporabljajo se za razlikovanje limfoproliferativnih sindromov in za diagnozo dlakave celične levkemije.

- trihromne obarvanosti

Trikrom Mallary-Azan

Uporabni so za razlikovanje citoplazme celic od vlaken vezivnega tkiva. Celice obarvajo rdeče, kolagena vlakna pa modro.

Massonov trihrom

To ima enako uporabnost kot prejšnja, vendar v tem primeru celice obarvajo rdeče, kolagena vlakna pa zeleno.

- Barvila, ki obarvajo posebne organele

Janus Green

Selektivno obarva mitohondrije.

Srebrne soli in osmična kislina

Obarva Golgijev aparat.

Toluidinsko modra

Obarva Nissijeva telesa

Srebrove soli in PAS

Obarvajo retikularna vlakna in bazalno plast.

Orcein in fuksinski resorcin

Barvajo elastična vlakna. S prvo so obarvani rjavo, z drugo pa globoko modro ali vijolično.

- Druge tehnike, ki se uporabljajo v citokemiji

Uporaba fluorescenčnih snovi ali fluorokromov

Obstajajo tehnike, ki uporabljajo fluorescenčne snovi za preučevanje lokacije strukture v celici. Te reakcije se vizualizirajo s posebnim mikroskopom, imenovanim fluorescenca. Primer: IFI tehnika (indirektna imunofluorescenca).

Zaznavanje celičnih komponent z imunocitokemijo

Te tehnike so v medicini zelo koristne, saj pomagajo zaznati določeno celično strukturo in jo tudi količinsko opredeliti. Ta reakcija temelji na reakciji antigen-protitelo. Na primer: ELISA tehnike (Enzimski imunski test).

priporočila

- Za oceno dobrega delovanja barvil je potrebno uporabiti kontrolne razmaze.

- Za citokemično obarvanje je treba uporabiti sveže razmaze. Če ni mogoče, jih je treba hraniti pred svetlobo in jih hraniti pri 4 ° C.

- Paziti je treba, da uporabljeni fiksativ ne vpliva negativno na snovi, ki jih je treba raziskati. Z drugimi besedami, preprečiti ga je treba, da bi ga lahko izločili ali zavirali.

- Upoštevati je treba čas uporabe fiksativov, saj na splošno naj traja le nekaj sekund, saj lahko daljši čas izpostavljenosti fiksativu škodimo nekaterim encimom.

Reference

1. "Citokemija." Wikipedija, prosta enciklopedija. 30. junij 2018, 17:34 UTC. 9. julij 2019, 02:53 Dostopno na: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metode kovinske impregnacije za proučevanje miokardnih retikularnih vlaken: primerjalna študija. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Dostopno na: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Citokemija kisle fosfataze: metodološki vidiki. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89–92. Dostopno na: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Celična in molekularna biologija. 11. izdaja Uredništvo Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Klasična orodja za preučevanje celične biologije. TP 1 (dopolnilni material) - Cell Biology. Dostopno na: dbbe.fcen.uba.ar