UREA JUHA: TEMELJ, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Sečnina brozgo je tekoči medij kulture, ki se uporabljajo za ugotavljanje prisotnosti ureaze encima v določenih mikroorganizmov. Ureaza je mikrobni encim, ki nastaja na konstitutiven način, torej se sintetizira ne glede na to, ali je substrat, na katerega deluje, ali ne.

Funkcija ureaze je povezana z razgradnjo organskih spojin. Vsi mikroorganizmi niso sposobni sintetizirati tega encima, zato njegova določitev v laboratoriju omogoča identifikacijo nekaterih bakterijskih sevov in celo razlikovanje med vrstami istega rodu.

Negativni in pozitivni test sečnine. Vir: Fotografijo avtor mag. Marielsa Gil.

Obstajata dve vrsti sečnine: Stuart in Christensen. Razlikujejo se po sestavi in ​​občutljivosti. Prva je posebna, da prikaže veliko količino ureaze, ki jo proizvajajo vrste rodu Proteus.

Drugi je bolj občutljiv in lahko zazna majhne količine ureaze, ki jo pozno ustvarijo drugi bakterijski rodovi, kot so Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter in Mycobacterium.

Stuart’s Urea broth je sestavljen iz sečnine, natrijevega klorida, kalijevega fosfata, monokalijevega fosfata, ekstrakta kvasa, fenolno rdeče in destilirane vode.

Medtem so Christensenovo sečnino ali agar sestavljeni iz peptonov, natrijevega klorida, monokalijevega fosfata, glukoze, sečnine, fenolno rdeče, destilirane vode in agar-agarja. Slednje samo, če je trdni medij.

Osnove

Encim ureaza hidrolizira sečnino in tvori ogljikov dioksid, vodo in dve molekuli amoniaka. Te spojine reagirajo in tvorijo končni produkt, imenovan amonijev karbonat.

Stuartov brod sečnina

Stuart-ova juha iz sečnine je bolj puferna s pH 6,8. Zato mora biti mikroorganizem sposoben tvoriti velike količine amoniaka, da postane fenol rdeč. PH naj se dvigne nad 8.

Zato je Stuart-ova sečnina izbirčna za vrste Proteus, saj daje pozitivne rezultate v 24 do 48 urah po inkubaciji, in ni učinkovita za bakterije, ki proizvajajo majhne količine sečnine ali ki sečnino počasi hidrolizirajo.

To je zato, ker vrste Proteus lahko uporabljajo sečnino kot vir dušika. Namesto tega druge bakterije, ki proizvajajo ureazo, potrebujejo dodaten vir.

Vendar pa Pérez in sod. (2002) so ugotovili, da je Stuart-ova sečninska brozga enako učinkovita kot Christensenov agar sečnine pri določanju sečnine v sevih kvasovk iz rodov Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon in Saccharomyces.

Avtorji študije trdijo, da so pri 24 in 48 urah inkubacije dosegli 100-odstotno soglasje z obema medijem (Stuart in Christensen); z izjemo, da so sevi, ki jim je uspelo medij spremeniti v močno rožnato-fuksio barvo, sprejeli kot pozitivne.

To pojasnilo je potrebno, saj je Lodder (1970) izjavil, da skoraj vsem kvasovkam uspeva naklon sečnine Christensen agar spremeniti v bledo roza. To je posledica dejstva, da lahko hidrolizirajo sečnino v minimalnih količinah, in tvorbo aminov z oksidativno dekarboksilacijo aminokislin na površini. To se ne sme razumeti kot pozitivno.

Christensenov Urea Agar ali broth

Christensen-ova sečnina ali agar je manj pufran in lahko odkrije majhne količine amoniaka. Poleg tega je ta medij obogaten s peptoni in glukozo. Te spojine povzročijo, da se v jurju Stuart razrastejo drugi mikroorganizmi, ki proizvajajo ureazo, in ki ne rastejo.

Prav tako Christensen test sečnine nudi hitrejše rezultate, zlasti pri Proteusu, saj lahko daje le pozitivne rezultate v samo 30 minutah kot minimalni čas in do 6 ur kot največji čas.

Preostali mikroorganizmi, ki proizvajajo ureazo, uspejo barvo medija nekoliko spremeniti po 6 urah, močno pa po 24, 48, 72 urah ali več, celo nekateri sevi lahko po 5 ali 6 dneh povzročijo šibke reakcije.

Interpretacija obeh medijev (Stuart in Christensen)

Medij je prvotno rumeno-oranžne barve, pozitivna reakcija pa bo barvo medija pretvorila v rožnato-fuksijo. Intenzivnost barve je neposredno sorazmerna s količino proizvedenega amoniaka.

Negativna reakcija bo pustila medij prvotne barve, razen kvasovk, ki se lahko spremenijo v Christensenovo sredstvo za agar sečnine.

Priprava

Stuartov brod sečnina

Tehtajte potrebne grame glede na navedbe trgovskega podjetja. Raztopimo v prednostno sterilni destilirani vodi. Ne uporabljajte toplote za raztapljanje, saj je sečnina občutljiva na toploto.

Membranska filtracija se uporablja za sterilizacijo. Za to se uporablja Millipore filter s pore s premerom 0,45 µ. Ne uporabljajte avtoklava. Ko je raztopina filtrirana, se porazdeli v sterilne epruvete. Da bi dobili zanesljive rezultate, ga je treba prenesti med 1,5 ml kot najmanjšo količino in 3 ml kot največjo količino na epruveto.

Shranjujte v hladilniku in ogreti pred uporabo.

Če metoda filtracije ni na voljo, je treba nemudoma uporabiti medij, da dobite zanesljive rezultate.

Drug način za pripravo Stuartove juhe iz sečnine je naslednji:

Nekatere komercialne hiše prodajajo osnovni medij za preskus sečnine, ne vključujejo sečnine.

Količino, ki jo navede komercialno podjetje, se stehta. Raztopimo ga v destilirani vodi in 15 minut steriliziramo v avtoklavu pri 121 ° C. Pustimo malo počivati ​​in ko je medij topel, dodamo 100 ml raztopine sečnine, pripravljene na 20%, in jo steriliziramo s filtracijo.

Razdeljen je v sterilnih epruvetah, kot je predhodno opisano.

Christensenov Urea Agar ali broth

-Priprava raztopine sečnine

Odtehtamo 29 g dehidrirane sečnine in raztopimo v 100 ml destilirane vode. Za sterilizacijo uporabite filtracijsko metodo. Ne avtoklavirajte.

-Ugar bazni agar

24 g dehidriranega baznega agarja raztopimo v 950 ml destilirane vode. Sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C 15 minut. Pustite počivati, dokler ne doseže temperature 50 ° C in aseptično dodajte predhodno pripravljeno sečnino.

V sterilne epruvete nalijemo 4-5 ml in nagnemo, dokler ni trdno. Moral bi biti dolg kljun flavte.

Ta medij lahko pripravimo tudi v tekoči obliki.

Prijave

Test sečnine je glede na hitro reakcijo, ki jo nudi Proteus, izredno učinkovit pri razlikovanju rodu Proteus od drugih rodov družine Enterobacteriaceae.

S pomočjo sestave Christensen test pomaga razlikovati med vrstami istega rodu. Na primer, S. heemolyticus in S. warneri sta koagulazno-negativni in beta-hemolitični stafilokok, vendar se razlikujeta po tem, da je S. heemolyticus sečnina in S. warneri pozitiven.

Po drugi strani je McNulty uspešno uporabil Christensenovo 2-odstotno sečnino sečnino, da je preučil prisotnost bakterije Helicobacter pylori v vzorcih biopsije, odvzetih iz želodčne sluznice (antralna regija).

Prisotnost H. pylori dokazuje pozitiven test sečnine. Trajanje opazovanja rezultatov je neposredno sorazmerno s količino mikroorganizmov.

Kot je razvidno, gre za preprosto metodo za diagnozo Helicobacter pylori pri želodčnih biopsijah.

Nazadnje je ta test uporaben tudi za razlikovanje vrst iz rodov Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus in Mycobacteria.

Setev testa sečnine

Obe metodi zahtevata močan mikrobni inokulum za optimizacijo rezultatov. Bakterijske kolonije se prednostno odvzamejo iz krvnega agarja, kvasovke pa iz Sabouraudovega agarja, z nekaj izjemami. Inokulum se emulgira v tekočem mediju.

Za odmrznitev sečnine Stuart inkubirajte pri 37 ° C 24 do 48 ur, pri čemer veste, da iščete sevov Proteus le, če je sev bakterija. Za kvasovke ga lahko inkubiramo pri 37 ° C ali pri sobni temperaturi 24 do 48 ur inkubacije.

V primeru Christensenove sečnine sečnina se inkubira pri 37 ° C 24 ur. Če je test negativen, ga lahko inkubiramo do 6 dni. Če je test pozitiven pred 6 urami, to kaže, da gre za sev rodu Proteus.

V primeru Christensenovega agarja sečnine je agarni naklon močno inokuliran, ne da bi prebijal. Juha se inkubira in razlaga na enak način.

QA

Za preskušanje medija se lahko uporabljajo kontrolni sevi, kot so Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 in Salmonella typhimurium. Prva dva naj bi dala pozitivne rezultate, zadnja dva pa negativna.

Vir: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.

Reference

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Uporaba Stuartove juhe iz sečnine za test ureaze kot test pri diagnozi kvasa. Rev. Soc. Ven. Mikrobiol. 2002; 22 (2): 136-140. Dostopno na: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testi za identifikacijo bakterij kliničnega pomena. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (agarna baza sečnine) 2015. Dostopno na: britanialab.com