BIURET: UTEMELJITEV, REAGENTI, POSTOPEK, UPORABE - BIOLOGIJA - 2026

Biureta je reagent za določanje proteinov dolgoverižnih in kratke verige. Zlasti se uporablja na področju analitične kemije in analize urina za raziskovanje koncentracije skupnih beljakovin v serumu, plazmi in urinu.

Vrednosti beljakovin se lahko pri določenih patologijah povečajo ali zmanjšajo. Simptomi hipoproteinemije se običajno pojavijo pri bolnikih z ledvično boleznijo, pri podhranjenih bolnikih in pri bolnikih s kroničnimi okužbami.

Kemična zgradba kompleksa, nastalega pri biuretovem reakciji z pozitivnim biuretom. Vir: Yikrazuul / flickr

Medtem ko hiperproteinemijo opazimo pri patologijah, kot so multipli mijelom, sistemski eritematozni lupus, bakterijski endokarditis, bakterijski meningitis, Waldenstromova makroglobulinemija, med drugimi.

Po drugi strani je prisotnost beljakovin v urinu posledica filtracije albumina po ledvicah. To je patološko vedenje, ki ga je treba proučiti.

V tem smislu je biuret zelo uporaben, saj omogoča količinsko določitev prisotnosti beljakovin v serumu, plazmi, urinu med številnimi drugimi vzorci.

Tudi Biuret lahko uporabimo za raziskovanje prisotnosti in koncentracije beljakovin v slabo raziskanih vzorcih ali vzorcih neznane sestave. Zato se široko uporablja na raziskovalnem področju.

Biuretov test temelji na zaznavanju peptidnih vezi. Preskus poteka v alkalnem mediju. Vzorec mora vsebovati vsaj dve peptidni vezi, da se tvori vijolično-vijoličen kompleks. Kompleks nastane z združitvijo vezi in bakrovega iona.

Osnove

Biuretov reagent je sestavljen iz kalijevega hidroksida, kurikovega sulfata ter natrijevega in kalijevega tartrata. Natrijev hidroksid se uporablja za alkalizacijo gojišča, saj je to stanje bistveno za reakcijo.

Snovi, ki reagirajo z beljakovinami, je kurikov sulfat, natrijev tartrat pa ne dopušča nastanka bakrovega hidroksida, ki se obarva in moti reakcijo.

Če v vzorcu najdemo snovi s peptidnimi vezmi (polipeptidi ali beljakovine), bo test pozitiven.

Reakcija se razlaga kot pozitivna, ko raztopina postane vijolična. Barva nastane s tvorbo kompleksa med vsaj dvema peptidnima vezoma, ki imata skupino CO-NH, in klorove katione.

Vijolični kompleks je mogoče tvoriti na dva načina: eden je z izgubo protonov iz amidnih skupin, ki se vežejo na kovino (depronotacija), drugi pa z združitvijo kisikovih in dušikovih elektronov, ki so prosti in se vežejo z bakrom.

Ta reakcija se lahko razlikuje po intenzivnosti in barvi, odvisno od vrste beljakovin.

Preizkus se lahko izvede kvalitativno ali količinsko. V kvalitativni obliki se poroča kot pozitivno ali negativno. Medtem ko je v kvantitativni obliki koncentracijo mogoče izmeriti s spektrofotometrično metodo.

Reakcija se odčita med 540-560 nm. Intenzivnost barve je neposredno sorazmerna s koncentracijo peptidnih vezi v vzorcu.

Reagenti

-20% natrijev hidroksid (NaOH)

-Cupric sulfat pentahidrat 1% (CuSO ₄ 5H ₂ O)

-Mixed natrijev in kalijev tartrat tetrahidrat (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Stabilnost reagenta biureta

- Hraniti ga je treba v hladilniku.

Proces

Tehnika

- V epruveto namestite 100 µl vzorca ali standarda za analizo.

-Dodajte 2 ml natrijevega hidroksida.

- Dobro mešajte.

-Dodajte 5 ml biuretskega reagenta.

-Mesite in pustite počivati ​​25 minut pri sobni temperaturi, pokrijte in zaščitite pred svetlobo.

-Opazujte nastajanje barve ali ne in merite spektrofotometrično.

Kalibracijska krivulja

Goveji serumski albumin se lahko uporablja kot standard za izvajanje kalibracijske krivulje. Iz njega se pripravijo različne koncentracije. Na primer 25, 50, 75, 100, 125 in 150%.

Reakcijo nastavimo z vsemi temi znanimi koncentracijami in odčitamo absorbanco pri valovni dolžini 540 nm. S podatki o znanih koncentracijah in odčitkih absorbance se izdela kalibracijska krivulja.

Pri vsaki določitvi ali seriji obdelanih vzorcev je priporočljivo vgraditi standard. Kot kalibracijski standard se lahko uporablja goveji serumski albumin 0,1-2 mg / ml.

Meritve se opravijo na spektrofotometru pri 540 nm.

Linearnost je dosežena do koncentracije 12 g / dl.

Vmešavanje

Snovi, ki motijo ​​Biuretov test

Čeprav to ni zelo pogosto, je treba opozoriti, da lahko nekatere snovi med izvedbo tega testa motijo. Na primer, prisotnost amoniaka lahko zavira nastajanje barv.

Tudi druge snovi bi lahko absorbirale na isti valovni dolžini, kot so nekateri pigmenti.

Po drugi strani pa lahko nastanejo interference, kadar snov, ki ni peptidna vez, tvori kompleks s kurirsko soljo. Primer: nekaj ogljikovih hidratov in določenih lipidov.

Če vzorec, ki ga je treba analizirati, vsebuje neko vrsto oborine, jo je treba pred namestitvijo preskusa filtrirati ali centrifugirati.

Snovi, ki ne motijo ​​Biuretovega testa

Na preskus ne vpliva prisotnost:

-Bilirubin do koncentracije 20 mg / dl.

-Hemoglobin do koncentracije 750 mg / dl.

-Dekstran do koncentracije 30 g / L

-Trigliceridi do koncentracije 4000 mg / dl.

Prednost

-To je preprost način izvedbe.

- To je ekonomski test.

-Ima beljakovin specifično.

-Majhne motnje.

Slabosti

Ima slabo občutljivost za zaznavanje nizkih količin beljakovin. Delo, ki ga je izvedlo Fuentes in sod., Potrjuje, da ima testna metoda Biuret mejo zaznavnosti 1 mg / ml beljakovin in mejo količinskega merjenja 3 mg / ml.

Vendar pa druge raziskave, izvedene na Univerzi v Amazoniji, poročajo o veliko nižjih vrednostih. Meja odkrivanja, o kateri je poročala študija, je 0,020 mg / ml, mejna količinska vrednost pa je 1,33 mg / ml.

Prijave

Biuretov reagent ali test se uporablja za določanje beljakovin v kliničnih in nekliničnih vzorcih v rutinskih in raziskovalnih laboratorijih.

Patologije, ki se pojavijo s povečanjem ali zmanjšanjem

Pri številnih patologijah je pomembno določiti koncentracijo celotnih beljakovin v kliničnih vzorcih, ki so lahko povišane ali zmanjšane.

Povišane so v:

-Mnogo mieloma,

-Sistemski eritematozni lupus,

-Bakterijski endokarditis,

-Bakterijski meningitis,

Waldenstromova makroglobulinemija, med drugim.

Zmanjša se v:

- ledvična insuficienca,

-Ljudje s hudo stopnjo podhranjenosti,

-Patienti s kroničnimi okužbami, med drugim.

Klinični vzorci

Najpogostejši klinični vzorci so serum, plazma in urin. Normalna vrednost beljakovin v serumu ali plazmi je 6,0-8,8 gr / dl.

Koncentracija beljakovin v urinu pri odraslih ne presega vrednosti 150 mg / 24 ur.

Razmerje med beljakovinami v urinu in kreatininom v urinu normalna vrednost

Dojenčki: <0,50 mg

Otroci, stari 2 leti in več: indeks: 0,20 mg

Odrasli: <0,2 mg

Predklinični vzorci

Reakcijo Biuret lahko uporabimo za številne vrste nekliničnih vzorcev, na primer mlečne izdelke, antivenom ali katero koli neznano snov, za katero želite raziskati prisotnost beljakovin.

Reference

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Fizikalno-kemijska karakterizacija in vsebnost beljakovin v tekočih izvlečkih ostrige mangrove (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66–74. Pridobljeno 26. junija 2019 z http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Funkcionalna karakteristika mandljevih semen manga (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67–75
3. "Biuret." Wikipedija, prosta enciklopedija. 19. junij 2019, 16:37 UTC 26. junij 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Standardizacija Biuretove metode za količinsko določitev skupnih beljakovin v polivalentnem antibotropnem serumu, proizvedene v Nacionalnem centru za biološke izdelke INS. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11–12). Dostopno na: repositorio.ins.gob.pe
5. Winer Laboratories. Skupaj beljakovine. Kolorimetrična metoda za določanje skupnih beljakovin v serumu in plazmi. Dostopno na: wiener-lab.com.ar