RESTRIKTIVNI ENCIMI: FUNKCIJE, VRSTE IN PRIMERI - BIOLOGIJA - 2026

V restrikcijskimi encimi so endonukleazami zaposlene pri določenem arheje in bakterije, da inhibirajo ali "omejujejo" širjenja virusov v notranjosti. Posebej so pogoste pri bakterijah in so del njihovega obrambnega sistema pred tujo DNK, znano kot sistem omejevanja / spreminjanja.

Ti encimi katalizirajo dvopasovno cepitev DNK na določenih lokacijah, reproduktivno in brez uporabe dodatne energije. Večina zahteva prisotnost kofaktorjev, kot so magnezij ali drugi dvovalentni kationi, čeprav nekateri potrebujejo tudi ATP ali S-adenozil metionin.

Reakcijska shema restrikcijskega encima HindIII (Vir: Helixitta prek Wikimedia Commons)

Omejevalne endonukleaze so leta 1978 odkrili Daniel Nathans, Arber Werner in Hamilton Smith, ki so za svoje odkritje prejeli Nobelovo nagrado za medicino. Njihovo ime na splošno izvira iz organizma, kjer jih prvič opazimo.

Takšni encimi se pogosto uporabljajo pri razvoju metod kloniranja DNK in drugih molekulskih biologij in strategij genskega inženiringa. Njihove posebne značilnosti prepoznavanja zaporedja in zmožnost rezanja zaporedij blizu prepoznavnih mest so močna orodja pri genetskem eksperimentiranju.

Fragmente, ustvarjene z restrikcijskimi encimi, ki so delovali na določeno molekulo DNK, lahko uporabimo za ponovno ustvarjanje "zemljevida" prvotne molekule z uporabo informacij o mestih, kjer encim razreže DNK.

Nekateri restrikcijski encimi imajo lahko na DNK isto mesto prepoznavanja, vendar ga ni nujno, da ga razrežejo na enak način. Tako obstajajo encimi, ki sekajo zapuščajoče konce, in encimi, ki režejo kohezivne konce, ki imajo v molekularni biologiji različne namene.

Trenutno obstaja na stotine različnih komercialno dostopnih restrikcijskih encimov, ki jih ponujajo različne komercialne hiše; Ti encimi delujejo kot "prilagojene" molekularne škarje za različne namene.

Lastnosti

Restriktivni encimi izpolnjujejo nasprotno funkcijo polimeraz, saj hidrolizirajo ali pretrgajo estrsko vez znotraj fosfodiesterske vezi med sosednjimi nukleotidi v nukleotidni verigi.

V molekularni biologiji in genskem inženiringu se pogosto uporabljajo orodja za gradnjo ekspresijskih in klonirajočih vektorjev, pa tudi za identifikacijo specifičnih sekvenc. Uporabni so tudi za gradnjo rekombinantnih genomov in imajo velik biotehnološki potencial.

Nedavni napredek genske terapije trenutno uporablja restrikcijske encime za vnos določenih genov v vektorje, ki so nosilci za prenos takšnih genov v žive celice in ki imajo verjetno možnost vstavljanja v celični genom za izvajanje trajne spremembe.

Mehanizem delovanja

Restriktivni encimi lahko katalizirajo dvopasovno cepitev DNK, čeprav so nekateri sposobni prepoznati enopasovno zaporedje DNK in celo RNA. Rezanje nastane po prepoznavanju zaporedij.

Mehanizem delovanja je sestavljen iz hidrolize fosfodiesterske vezi med fosfatno skupino in deoksiribozo v okostju vsakega verige DNA. Številni encimi se lahko razrežejo na istem mestu, kot ga prepoznajo, medtem ko drugi režejo med 5 in 9 baznih parov pred ali po njem.

Običajno se ti encimi razrežejo na 5 'koncu fosfatne skupine, kar povzroči fragmente DNK s 5' fosforilnim koncem in 3 'končnim hidroksilnim koncem.

Ker beljakovine ne pridejo v neposreden stik s prepoznavnim mestom v DNK, jih je treba premeščati zaporedno, dokler ne dosežemo določenega mesta, morda s pomočjo "drsnih" mehanizmov na verigi DNK.

Med encimskim cepitvijo se fosfodiesterska vez vsakega od verig DNA nahaja v enem od aktivnih mest restrikcijskih encimov. Ko encim zapusti mesto prepoznavanja in cepitve, to stori prek nespecifičnih prehodnih asociacij.

Vrste

Trenutno je znanih pet vrst restrikcijskih encimov. Tu je kratek opis vsakega od njih:

Omejitveni encimi tipa I

Ti encimi so veliki pentamerni proteini s tremi podenotami, eno za restrikcijo, eno za metilacijo in eno za prepoznavanje zaporedja v DNK. Te endonukleze so večnamenske beljakovine, ki lahko katalizirajo restrikcijske in modifikacijske reakcije, imajo ATPazno aktivnost in tudi DNK topoizomerazo.

Tovrstni encimi so bili prvi odkriti endonukleazi, prvič so jih očistili v šestdesetih letih prejšnjega stoletja in jih od takrat preučevali v veliki globini.

Encimi tipa I se ne uporabljajo široko kot biotehnološko orodje, saj je mesto cepitve lahko na razdaljeni razdalji do 1.000 baznih parov od mesta prepoznavanja, kar jih naredi za nezanesljive v smislu eksperimentalne obnovljivosti.

Restriktivni encimi tipa II

So encimi, sestavljeni iz homodimerov ali tetramerov, ki razrežejo DNA na določenih mestih v dolžini med 4 in 8 bp. Ta mesta cepitve so običajno palindromna, torej prepoznajo sekvence, ki se berejo na enak način v obe smeri.

Številni restrikcijski encimi tipa II v bakterijah razrežejo DNK, ko prepoznajo njen tuji značaj, saj nima značilnih sprememb, ki bi jih moral imeti lastni DNK.

To so najpreprostejši restrikcijski encimi, saj za prepoznavanje in rezanje zaporedja DNA ne potrebujejo nobenega kofaktorja razen magnezija (Mg +).

Natančnost restrikcijskih encimov tipa II pri prepoznavanju in rezanju preprostih sekvenc v DNK na natančnih položajih jih uvršča med najbolj razširjene in nepogrešljive v večini vej molekularne biologije.

Znotraj skupine restrikcijskih encimov tipa II obstaja več podrazredov, razvrščenih po določenih lastnostih, ki so značilne za vsakega. Razvrstitev teh encimov se izvede z dodajanjem črk abecede, od A do Z, ki sledi imenu encima.

Nekateri izmed podrazredov, ki so najbolj znani po uporabnosti, so:

Podrazred IIA

So dimerji različnih podenot. Prepoznajo asimetrična zaporedja in se uporabljajo kot idealni predhodniki za tvorbo rezalnih encimov.

Podrazred IIB

Sestavljeni so iz enega ali več dimerjev in razrežejo DNA na obeh straneh prepoznavnega zaporedja. Prerezali sta oba pramena DNK interval baznega para pred mestom prepoznavanja.

Podrazred IIC

Encimi te vrste so polipeptidi s funkcijami delitve in modifikacije verig DNK. Ti encimi razrežejo oba pramena nesimetrično.

Podrazred IIE

Encimi tega podrazreda se najbolj uporabljajo v genskem inženiringu. Imajo katalitično mesto in na splošno potrebujejo alosterni efektor. Za učinkovito cepitev morajo ti encimi medsebojno delovati z dvema kopijama njihovega zaporedja prepoznavanja. Znotraj tega podrazreda sta encima EcoRII in EcoRI.

Restriktivni encimi tipa III

Omejevalne endonukleze tipa III so sestavljene iz samo dveh podenot, ena je odgovorna za prepoznavanje in spreminjanje DNK, druga pa je odgovorna za cepljenje zaporedja.

Ti encimi za svojo funkcijo potrebujejo dva kofaktorja: ATP in magnezij. Restriktivni encimi te vrste imajo dva asimetrična mesta prepoznavanja, premeščajo DNK na način, odvisen od ATP, in ga razrežejo med 20-30 bp poleg mesta za prepoznavanje.

Restriktivni encimi tipa IV

Encime tipa IV je enostavno prepoznati, saj režejo DNK z metilacijskimi znamkami, sestavljeni so iz več različnih podenot, ki so odgovorne za prepoznavanje in rezanje zaporedja DNK. Ti encimi uporabljajo GTP in dvovalentni magnezij kot kofaktorje.

Specifična mesta cepitve vključujejo nukleotidne niti z metiliranimi ali hidroksimetiliranimi citozinskimi ostanki na enem ali obeh nizih nukleinskih kislin.

Omejitveni encimi tipa V

Ta razvrstitev združuje encime tipa CRISPER-Cas, ki identificirajo in odrežejo specifične sekvence DNA iz invazivnih organizmov. Encimi Cas uporabljajo pramen RISPER sintetiziranega vodnika RNA za prepoznavanje in napadanje invazivnih organizmov.

Encimi, razvrščeni kot tip V, so polipeptidi, strukturirani po encimih tipa I, II in II. Izrežejo lahko odseke DNK skoraj vsakega organizma in s širokim razponom dolžine. Zaradi svoje fleksibilnosti in enostavne uporabe so ti encimi eno najbolj razširjenih orodij v genskem inženiringu danes, skupaj z encimi tipa II.

Primeri

Omejevalni encimi so bili uporabljeni za odkrivanje polimorfizmov DNA, zlasti v populacijskih genetskih študijah in evolucijskih študijah z uporabo mitohondrijske DNK, da bi dobili informacije o hitrosti nukleotidnih substitucij.

Trenutno imajo vektorji, ki se uporabljajo za transformacijo bakterij za različne namene, mesta, ki imajo več loka, na katerih lahko najdemo mesta za prepoznavanje za več restrikcijskih encimov.

Med temi encimi so najbolj priljubljeni EcoRI, II, III, IV in V, pridobljeni in opisani prvič iz E. coli; HindIII iz H. influenzae in BamHI iz B. amyloliquefaciens.

Reference

1. Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Biologija omejitve DNA. Mikrobiološki pregledi, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR zagotavlja pridobljeno odpornost proti virusom v prokariotih. Science, 315 (marec), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Molekularna perspektiva: Restriction Endonucleases. Temeljne celice: Osnove medicine raka, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Skakanje, skakanje in zanko z restrikcijskimi encimi. Transakcije Biokemične družbe, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Vzdrževanje identitete vrst in nadzor specifikacije bakterij: nova funkcija za sisteme omejevanja / spreminjanja? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewinovi geni XII (12. izd.). Burlington, Massachusetts: Učenje Jonesa in Bartletta.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Uporabljajte CRISPR-Cas sisteme tipa I in III za urejanje genomov. Raziskave nukleinskih kislin, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Omejevalni encimi tipa I in njihovi sorodniki. Raziskave nukleinskih kislin, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriction Endonucleases pri analizi in prestrukturiranju molekul DNK. Annu Rev. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Polimorfizem DNA, ki ga je mogoče zaznati z restrikcijskimi endonukleazami. Genetika, 145–163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Celične in molekularne vede o omejitvi endonukleaze: struktura in mehanizem. Znanosti o celičnem in molekularnem življenju CMLS, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Kako so restrikcijski encimi postali delovni konji molekularne biologije. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ in Murray, K. (1976). Omejevalna endonukleaza. Kritični pregledi v biokemiji, (november), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Struktura in funkcija domačega endonukleaze. Četrtletni pregledi biofizike, 1–47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Biologija omejevanja in preprečevanja. Trenutno mnenje iz mikrobiologije, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG, & Murray, NE (1991). Omejevalni in spreminjalni sistemi. Annu Rev. Genet. , 25, 585–627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genski vpogled v virulenco Campylobacter jejuni in populacijsko genetiko. Infek. Dis. Prevedi Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Struktura in mehanizem večfunkcijskih restriktivnih izpustov. Annu Rev. Biochem. , 50, 285–315.