NEGATIVNO OBARVANJE: UTEMELJITEV, TEHNIKA, PREDNOSTI IN SLABOSTI - BIOLOGIJA - 2026

Negativno obarvanje je metoda posebno barvanje poudariti prisotnost kapsule v nekaterih mikroorganizmov , predvsem Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae in Cryptococcus neoformans-, iz kliničnih primerkov ali čistih kultur.

Neposredni vzorec, ki se običajno uporablja za negativno obarvanje, je cerebrospinalna tekočina. Ta tehnika predstavlja hitro alternativo domnevni diagnozi meningitisa, zlasti Cryptococcus neoformans.

A. Zobni vinski kamen, obarvan z indijskim črnilom, B. Cryptococcus neoformans var gatti se v naravi slabo inkapsulira, tako da uporablja nigrosin. C. Cryptococcus neoformans var gatti z debelo kapsulo, kot jo najdemo v parazitski obliki, z uporabo nigrosina. D. Cryptococcus neoformans z rahlo razredčenim indijskim črnilom. Gisell Quinde, iz Wikimedia Commons / CDC, prek Wikimedia Commons / Kreditna fotografija: Ponudniki vsebin: CDC / Dr. Leanor Haley, prek Wikimedia Commons

Prav tako se ta madež lahko nanese na sputum in sterilne tekočine na splošno, pa tudi na seve, pridobljene iz mladih čistih kultur. Ta tehnika za izvedbo uporablja nigrosin ali indijsko črnilo; zato je zelo enostavno in poceni uporabiti metodologijo, ki v kratkem času zagotavlja informacije velike diagnostične vrednosti.

V tem smislu je kateri koli laboratorij sposoben izvesti to obarvanje. Seveda mora laboratorij imeti usposobljeno osebje, ki lahko prepozna izolirane kvasovke Cryptococcus neoformans ali jih povečuje in jih loči od levkocitov in artefaktov, ki jih lahko vzorec predstavlja.

Osnove

Nigrosin in indijska črnila delujejo na podoben način; zato je mogoče katero koli od obeh snovi uporabiti zamenljivo.

To tehniko imenujemo negativno obarvanje, ker deluje v nasprotju s preostalimi tehnikami obarvanja. Pri tem ostaja nepotešena struktura, ki jo iščejo ali želijo videti; torej mikroorganizmi.

Zato obarvanje temelji na obarvanju dna razmaza s temno barvo. V tem primeru bodo kapsulirane strukture izstopale v svetlobi ali brezbarvni barvi.

Na splošno so kvasovke odbojne, obdane s prozornim halo, ki ustreza kapsuli. To se zgodi, ker sta indijska črnilo in nigrosin snovi, ki ne morejo prodreti v polisaharid, ki sestavlja kapsulo živih mikroorganizmov.

Omeniti velja, da tudi druge strukture, ki so lahko prisotne v neposrednem vzorcu, na primer levkociti ali rdeče krvne celice, ne prodrejo.

Če so mikroorganizmi odmrli, lahko barvilo prodre v njih, tako da je to obarvanje koristno tudi za oceno sposobnosti mikroorganizmov.

Tehnika

materiali

Nigrosin

Nigrosin dolguje ime črni barvi, ki jo ima. Gre za sintetično snov, ki jo dobimo pri segrevanju mešanice organskih spojin - kot nitrobenzina, anilina in anilin hidroklorita - z uporabo katalizatorja (železa ali bakra) v omenjeni reakciji.

Kitajsko črnilo

Kitajsko črnilo je snov, ki jo Azijci uporabljajo predvsem za pisanje, likovna dela in enobarvno slikanje. V kitajski kulturi je zelo priljubljen.

Pridobiva se iz lignjevega črnila, pomešanega s prašnatim ogljem, produktom gorenja z nizko smolnatimi drevesi.

Možno ga je pripraviti tudi iz saje iz sežiganja ogljikovodikov (rastlinskih olj), skupaj z beljakovinsko želatino, ki ji daje pravo konsistenco, da se prepreči obarjanje ogljikovih delcev.

Specifikacije za vzorčenje

- Ne potrebuje posta.

- Vzorec CSF, sputuma ali sterilnega tekočine mora vsebovati najmanj 1 ml prostornine in ga je treba nemudoma prenesti v laboratorij pri sobni temperaturi.

- Vzorce CSF in sterilne tekočine mora odvzeti specializiran zdravnik.

- Lahko je tudi čista kultura sumljivega seva, povezanega z omenjenimi povzročitelji bolezni.

Izvedba tehnike z neposrednimi vzorci

- Vzorce je treba centrifugirati, supernatant se zavrže in se odvzame usedlina.

- Kapica centrifugiranega materiala (usedlina) in kapljica indijskega črnila ali nigrosina sta nameščena na čisti drsnik.

- Dobro ga je treba zmešati in prekriti s pokrovno ploščo, ki omogoča, da se kapljica razširi kot tanek film, ne da bi šla čez robove.

- Nato se pripravek namesti na mikroskop.

- Če je pripravek pretemen, ga lahko razredčimo z vodo.

Izvedba tehnike s sevi iz kulture

- Zelo majhen del mlade kulture vzamemo s semensko iglo in jo raztopimo v kapljici črnila Indije, ki smo jo predhodno postavili na čisti drsnik.

- Na zgornjem delu je pokrovček.

- V mikroskopu ga opazimo pri 10X in nato pri 40X.

Del kolonije lahko raztopite tudi v destilirani vodi, od tam pa vzamete kapljico in zmešate z indijskim črnilom. Na ta način pripravek ne bo tako gost, kar bi omogočilo opazovanje struktur v izolaciji; če je gneča, je ne bo dobro opaziti.

Druga metodologija je naslednja:

- Na en konec drsnika položite kapljico kulture suspenzije.

- Na isti konec dajte kapljico nigrosina in premešajte.

- S pomočjo drugega diapozitiva vzorec razširite, kot da bi naredili hematološki razmaz.

- Pod mikroskopom pustite, da se posuši.

Opazovanje mikroskopa

Najprej se morate osredotočiti z 10X ciljem, da boste imeli širok pogled na polje. Pozneje je treba iskati, če obstajajo jasni presledki; če obstajajo, se za podrobnosti izostrite 40X.

Prednost

- To je enostavno izvršiti.

- Je poceni tehnika.

- Ta metoda ne zahteva, da se razmaz pritrdi na toploto ali s kemikalijami; zato mikroorganizme opazujemo brez izkrivljanj.

- Svežega pripravka ni treba sušiti, zato ga lahko opazite takoj, kar hitro ustvari rezultate.

Slabost

Ko so sestavljeni, je treba takoj opaziti sveže pripravke; če jih pustimo, da se posušijo, jih ni več mogoče opazovati in je treba namestiti novega.

Obarvanje tkiv z indijskim črnilom

Druga funkcija, ki jo indijsko črnilo lahko izpolni, je v patoloških laboratorijih. To se uporablja za kirurško odvzete vzorce tkiv, da se označijo meje resekcije tumorja.

Označeno tkivo je razpršeno z ocetno kislino. Ta deluje kot mordant in preprečuje, da bi črnilo uhajalo, ko je tkivo podvrženo rutinski predelavi za biopsijski pripravek.

Postopek je sestavljen iz kopanja tkiva v alkoholu in ksilenu ter nato namočenje v parafinski vosek. Ta oznaka vodi patologa pri opazovanju tkiva in označuje, kje je meja kirurške resekcije ali druga zanimiva točka.

Reference

1. «Nigrosina». Wikipedija, prosta enciklopedija. 11. julij 2017, 22:46 UTC 6. januar 2019, 16:56: en.wikipedia.org
2. "Kitajsko črnilo". Wikipedija, prosta enciklopedija. 1. okt 2018, 03:08 UTC. 6. januar 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J in sodelavci. (2006). Delavsko osebje avtonomne skupnosti Extremadura. Posebni dnevni red Zvezek IV. Uredništvo MAD. Sevilja-Španija, str. 211–212.
4. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), specialistični laboratorijski tehnik, galicijska zdravstvena služba (SERGAS). Zbirka posebnega dnevnega reda 2. Uredništvo MAD. Sevilja-Španija, str. 79–80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Argentina. Uredništvo Panamericana SA