WRIGHTOV MADEŽ: UTEMELJITEV, MATERIALI, TEHNIKA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Wright madež je obarvanje tehnika, ki jo je ameriški tolog James Homer Wright ustvaril leta 1902, ki temelji na Romanowsky madež. Ker je bil Romanowsky madež nestabilen, je Wright metanol vključil kot topilo in fiksativo.

To barvanje je polikromno, kar pomeni, da ustvari več barv, odvisno od strukture, ki absorbira barvilo. Ta tehnika obarvanja se pogosto uporablja za izvajanje diferencialnega števila belih krvnih celic in za proučevanje morfologije rdečih krvnih celic, trombocitov in levkocitov v periferni krvi in ​​kostnem mozgu.

Različne razmaze periferne krvi, obarvane z Wrightovim madežem. A. Akutna levkemija B. Plasmodium vivax znotraj eritrocita. C. Plasmodium falciparum, makrogametocit. D. limfociti

Njegova uporaba je zelo pomembna, saj lahko v različnih celičnih linijah krvi opazimo nepravilnosti, kar olajša diagnozo bolezni, kot so levkemija ali bakterijske ali parazitske okužbe.

Morda so to najpogostejše aplikacije, pri katerih se uporablja ta tehnika, vendar niso edine. Uporabna je tudi v vzorcih, razen krvi in ​​kostnega mozga, kot so izcedek iz nosu, fekalna sluz, sputum, vzorci kože.

Utemeljitev Wrightovega madeža

Rright madež se je rodil iz madeža Romanowsky, ki je sestavljen iz raztopine metilnega alkohola kislega barvila (eozin Y) in osnovnega barvila (metilensko modrega) ter njihovih produktov oksidacije.

Mešanica barvil, ki se uporablja v Wrightovem madežu, povzroči učinek, znan kot Romanowsky, torej daje lepo vijolično barvo jedrom levkocitov in nevtrofilnih zrnc, rdeče krvne celice pa obarvajo rožnato.

Sestavni deli, odgovorni za dajanje značilne barvne razpona Wright-ovega madeža, sta modra B in eozin Y. Ugotovljeni učinek bo odvisen od vezave barvil na kemične strukture in interakcij modrega B in eozina Y.

Kisle strukture, kot so nukleinske kisline, jedrski proteini in reaktivna nezrela citoplazma nekaterih vrst celic, pritrdijo modro B (osnovni madež).

Medtem ko osnovne strukture, kot je hemoglobin, zrnca segmentiranih eozinofilcev med drugimi celičnimi strukturami vežejo eozin Y (kislo barvilo).

Na rezultat obarvanja lahko vplivajo različni dejavniki, kot so pH barvila Wright, pufer in raztopina za pranje; kot tudi čas obarvanja in fiksiranja.

Zato je vsak korak pri pripravi reagentov ključnega pomena in ga je treba izvesti pri vsaki podrobnosti.

materiali

Wright madež. Za 100 ml je potrebno:

Odtehtamo 0,3 g Wright-ovega madeža, izmerimo 97 ml metanola in 3 ml glicerola.

Priprava

V malto dajte veliko količino Wrightovega barvila in postopoma vključite glicerol, dokler se prašek popolnoma ne raztopi.

Nato dodamo metanol, premešamo in prelijemo v jantarno steklenico.

Pred uporabo raztopino potresemo z nežnimi gibi in filtriramo.

Puferirana raztopina pufra

V en liter destilirane vode dodamo 3,76 g dinatrijevega hidrofosfata (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) in 2,1 g dihidrogen kalijevega fosfata (KH ₂ PO ₄ ).

Zelo dobro premešamo, dokler se vsi vgrajeni reagenti ne raztopijo. PH prilagodite na 7,2. Nalijte v steklen kozarec in hranite na sobni temperaturi.

Dodatni materiali, potrebni za izvedbo barvanja

Poleg tega so za izvedbo tehnike barvanja potrebni še drugi materiali, to so: predmetni diapozitivi ali pokrovi predmetov, barvanje most, majice z vodo ali pufer za pranje, timer za ohranjanje časa barvanja in nekaj sušilnega materiala (vpojni papir, gaza ali bombaž).

Sestavni deli Wright madeža

Metanol

Alkohol (metanol) služi kot fiksativ razmaza krvi na diapozitivu.

Je v osnovi reagent za zmanjševanje, dehidriranje in fiksiranje koagulanta. Njegova naloga je torej strjevanje beljakovin in naredi netopne, vendar ne da bi jih dejansko denaturirala.

Metanol je najpogosteje uporabljen reagent za fiksiranje razmaza v vseh laboratorijih, saj zagotavlja boljše rezultate kot etanol. Idealna koncentracija je 99%.

Blažilnik

Pufer (puferirana raztopina) ima funkcijo prilagajanja ali vzdrževanja pH barvila, saj je pH, prilagojen na 7,2, nujen, da lahko celične strukture pravilno absorbirajo barvila.

Po drugi strani korak fiksacije metanola celice dehidrira, pufer pa jih pomaga ponovno hidrirati.

Eosin (Y)

Eozin ima afiniteto do gradnikov, ker je kislo barvilo. Poznamo dve vrsti eozina, ki sta si med seboj zelo podobni, toliko, da lahko uporabimo katero koli od obeh, da dobimo enak rezultat.

Eden se imenuje eozin Y, rumeni eozin ali tetrabromofluorescein, drugi pa se imenuje eozin B, modrikast eritrosin B ali dibromodinitrofluorescein. Vendar se najpogosteje uporablja eozin Y.

Najpomembnejša lastnost tega barvila je njegova negativna polarnost, zaradi česar ga privlačijo pozitivno nabiti celične strukture.

Metilen modro

Je osnovno barvanje. Njegova glavna lastnost je metahromasia, torej ne bodo vse strukture obarvane iste barve, odvisno je od kemične sestave struktur, ki jih obarvate.

Nekateri bodo postali svetlo ali temno modri, nekateri pa temno vijolično ali bledo lila.

Tehnika

1 - Razpršite vzorec tako, da ostane tanek film na drsniku ali na pokrovu.

2 - Pustite, da se na zraku suši približno 2 uri.

3 -Položite suh razmaz na most za obarvanje ali pladenj s širjenjem vzorca navzgor.

4 Pokrijte list s kapljico Wright kapljico po kap, dokler se celotna površina ne pokrije. Pustite delovati 5 - 8 minut.

5-madež mora popolnoma pokriti drsnik, ne da bi se razlival po robovih. Če med barvanjem začne izhlapevati, dodajte še nekaj dodatnih kapljic.

6-Nato dodajte enako količino amortizerja, pihajte malo, dokler se ne pojavi značilni kovinski sijaj. Čas 10 do 15 minut.

7-Operite z vodo iz pipe in položite nežen potok, dokler list ne postane roza.

8 -Z gazo, namočeno v alkohol, odstranite barvilo, nalepljeno na zadnjo stran diapozitiva.

9 - Pustite, da se razmaz dobro posuši, preden ga potopite, da si ga ogledate pod mikroskopom.

Uporabnost

Hematologija

Idealen je za obarvanje madežev periferne krvi, za pregled debelih krvnih razmikov in za preučevanje celic iz vzorcev kostnega mozga.

Zaradi kemijskih lastnosti te kombinacije barvil lahko celične strukture zlahka prepoznamo in razlikujemo različne vrste celic.

Smrkav nos

Ta tehnika je zelo koristna za prepoznavanje celic izcedka iz nosu (epitelijskih celic, segmentiranih eozinofilcev, polimorfonuklearnih celic) pri diagnozi alergijskega rinitisa.

parazitologija

V tem smislu je bilo koristno za preučevanje Leishmania sp znotraj histiocitov podkožnega celičnega tkiva pri kožnih razjedah. Prav tako se uporablja za identifikacijo levkocitov v vzorcih blata (fekalni levkogram).

V tem primeru je za zdravnika koristno vedeti, ali je levkocitoza, prisotna v blatu, polimorfonska ali mononuklearna. Ta ugotovitev v fekalnem levkogramu bo vodila, ali gre za bakterijsko ali virusno okužbo.

Po drugi strani lahko parazite, ki krožijo v krvi, najdemo znotraj eritrocita ali brez plazme. Iščeni zajedavci so Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii in filarias, v veterinarski medicini pa je uporaben pri iskanju Theileria equi in Babesia caballi, povzročiteljev bebesioze, zlasti pri konjih.

Wright madež in tudi madež Giemsa omogočata razlikovanje hemoparazitov od običajnih celičnih komponent. Za to je mogoče uporabiti dve vrsti namazov:

Širite tanko

Kri se širi kot tanek film na diapozitivu. Obarvan je z Wrightovim madežem, ki razkriva značilnosti jedra in citoplazme.

Debela kapljica

Ta metodologija se uporablja za raziskovanje prisotnosti parazitov v večji količini krvi.

Če želite to narediti, se na diapozitiv položi velika kapljica krvi. Ko je tam, ga je treba defibrilirati in narediti večje in večje kroge od sredine navzven, z robom drugega diapozitiva.

Nazadnje, da lahko opazimo parazite v debelem razmazu, je treba eritrocite lizirati z vodo.

Dihalne okužbe

Na stopnji dihanja je ta tehnika uporabna tudi zato, ker so celice v vzorcih sputuma, izpiranja bronhijev ali bronhoalveolarne pomembne za postavitev diagnoze.

Podobno lahko tu ločimo polimorfonske in mononuklearne celice.

Bakteriologija

Uporaba te tehnike v bakteriologiji je omejena, ker ni dobra za obarvanje bakterij, zato se za njihovo obarvanje uporabljajo druge specializirane tehnike obarvanja.

Vendar pa so ga uporabili za iskanje epitelijskih celic z vključevalnimi telesi Chlamydia trachomatis v maščobe sečnice ali endocervikalne sluznice, čeprav je treba priznati, da za to ni najboljša metoda.

Med rdečimi krvnimi celicami pri okuženih bolnikih lahko opazimo tudi spiralno podobne bakterije, kot je Borrelia burgdorferi, kot tudi morule ali vključevalna telesa Ehrlichia sp v citoplazmi limfocitov, monocitov ali nevtrofilcev v krvnem razmazu.

Mikologija

Histoplazma capsulatum je patogena gliva, ki jo pogosto diagnosticiramo z mikroskopskim opazovanjem različnih vzorcev tkiv, obarvanih z Wright-jevim madežem.

Kako opazimo strukture vzorca krvi z Wrightovim madežem?

Vir: Retamales E, Inštitut za javno zdravje Mazo V., Čile. Priporočila za obarvanje krvnih madežev za branje hemograma.

Priporočila za dobro obarvanje

Diapozitivi vzorcev krvi se morajo spontano posušiti. Razmazi naj bodo čim tanjši, da dobimo boljšo fiksacijo barvila in se izognemo pretiravanju.

Za kakovostno obarvanje je priporočljivo obarvati v dveh urah po pripravi razmaza. Po drugi strani je idealen vzorec kapilarna kri, brez antikoagulantov.

Če pa uporabimo vensko kri, jo moramo uporabljati kot antikoagulant EDTA in ne heparin, saj lahko slednji deformira celične strukture.

Da se pripravljeno barvilo ne bi poslabšalo, ga je treba hraniti na suhih mestih.

Med pranjem se priporoča uporaba vode, prilagojene nevtralnemu pH.

Nazadnje je priporočljivo občasno preizkusiti metode obarvanja, ki se uporabljajo v laboratoriju.

To se naredi z obarvanjem vzorcev ali razširjenimi vzorci kot kontrolo kakovosti. Ta korak je pomemben, saj zagotavlja, da je obarvanje pravilno pripravljeno in čas obarvanja dobro standardiziran.

Če je list z vzorci slabo obarvan, je treba težave rešiti.

Pogoste napake pri Wright obarvanju

Zelo bledo obarvanje

Zelo bledi razmazi so običajno posledica zelo kratkega časa obarvanja ali pretiranega pranja. Popravi se s podaljšanjem časa stika z barvilom ali s skrajšanjem časa pranja.

Barvne oborine

Prisotnost barvnih oborin v razmazu je lahko več vzrokov, vendar so najpogostejši vzroki: uporaba nefiltriranega barvila, obarvanje na neenakomernih obarvanih mostovih, uporaba listov, umazanih s prahom ali maščobo, ne umivanje dobro popolno obarvanje.

Izjemno rdeč ali modri razmaz

Pufer je odgovoren za pH barvila. Barvila s pH, ki je nižja od navedene (kisle), bodo povzročila zelo rdečkaste razmaze.

Če je pH barvila nad (alkalen), se bo izredno modrikasto razmazalo.

Način shranjevanja

Reagent je treba hraniti pri sobni temperaturi.

Reference

1. Gutiérrez V. Primerjalna študija med metodo Wright obarvanja in testom Elisa za diagnozo pasje ehrlichioze v mestu San Pedro Sula, Honduras. 2008. Diplomsko delo za pridobitev kvalifikacije za veterinarsko medicinsko stopnjo. Univerza San Carlos v Gvatemali.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Osnovni madeži v laboratoriju za mikrobiologijo. Raziskave na področju invalidnosti. 2014; 3 (1): 10–18.
3. "Wright je madež." Wikipedija, prosta enciklopedija. 18. maj 2018, 12:05 UTC 8. dec 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Pogostost bakterije Babesia spp. pri lovu na konje, Córdoba (Kolumbija). Rev. udcaactual divulg cient. 2013; 16 (2): 451–458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Argentina. Uredništvo Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Inštitut vlade za javno zdravje Čila. Priporočila za obarvanje krvnih madežev za branje hemograma.