BARVANJE S SPORI: UTEMELJITEV, TEHNIKE IN UPORABE - BIOLOGIJA - 2026

Spor obarvanje je metodologija za barvanje struktur upora, ki tvorijo neko bakterijske rodove ko v neugodnih pogojih; Te strukture ustrezajo obliki preživetja.

Obstaja veliko rodov, ki tvorijo spore; glavni pa sta Bacillus in Clostridium. Ti rodovi veljajo za pomembnejše, ker imajo patogene vrste za človeka.

Obarvanje s sporom po metodi Shaeffer - Fulton ali Wirtz-Conklin. In tambe (izvirni nalagalec), z Wikimedia Commons

Vsak bacil lahko povzroči nastanek spore. V času obarvanja pripravka lahko spore najdemo znotraj bacila (endospore) ali zunaj njega (exospore). Z običajnimi tehnikami obarvanja bakterij - kot je na primer Gram - spore ostanejo brezbarvne.

Trenutno obstaja več metodologij obarvanja, ki lahko prodrejo v debelo strukturo spore, da jo barvajo. Te metodologije so zelo raznolike; Sem spadajo tehnika Dorner, madež Möeller in metodologija Shaeffer - Fulton, znana tudi pod imenom Wirtz-Conklin.

Od vseh omenjenih tehnik se v rutinskih laboratorijih najpogosteje uporablja metodologija Shaeffer-Fulton. Poimenovana je po dveh mikrobiologov, ki sta obarvanost ustvarila leta 1930: Alicia Shaeffer in MacDonald Fulton. Vendar pa se tehniki včasih poimenuje Wirtz-Conklin po dveh bakteriologih iz 1900-ih.

Osnove

Spore ne obarvajo z običajnimi madeži, ker imajo zelo debelo steno. Kompleksna sestava spore preprečuje vstop večine barvil.

Če spore preučujemo od zunaj, opazimo naslednje plasti: najprej je tu eksosporij, ki je najtanjša in zunanja plast, ki jo tvorijo glikoproteini.

Sledi kutikula, ki zagotavlja odpornost na visoke temperature, sledi korteksa, sestavljena iz peptidoglikana. Kasneje je stena podstavka, ki ščiti protoplast.

Spore so dehidrirana struktura, ki vsebuje 15% kalcija in dipikolinske kisline. Zaradi tega se večina tehnik obarvanja s sporo opira na uporabo toplote, tako da barvilo lahko prodre skozi debelo strukturo.

Ko je spora obarvana, barvila ne more odstraniti. V tehniki Shaeffer - Fulton malahitna zelena vstopi v vegetativne celice in pri vročini prodre tako v endospor kot tudi v eksospore.

S spiranjem z vodo se barvilo odstrani iz vegetativne celice. Do tega pride, ker je malahitno zeleno barvilo rahlo bazično, zato se slabo veže na vegetativno celico.

Namesto tega se ne more spraviti iz spore in na koncu se bacili zoperstavijo safraninu. Ta podlaga velja za ostale tehnike, v katerih se zgodi nekaj podobnega.

Tehnike obarvanja s spori

Za izvedbo obarvanja spore je treba pridobiti čisto kulturo sumljivega seva, ki ga je treba preučiti.

Kultura je podvržena ekstremnim temperaturam 24 ur, da se mikroorganizem spodbudi k sporulaciji. Za to lahko kulturo postavimo v pečico pri 44 ° C ali v hladilnik (8 ° C) za 24 ali 48 ur.

Če ga pred omenjenimi temperaturami pustimo predolgo, bomo opazili le eksospore, saj bodo vsi endospori že zapustili bacilo.

Ob koncu časa je treba na čisti diapozitiv postaviti nekaj kapljic sterilne fiziološke raztopine. Nato se odvzame majhen del kulture in naredi droben namaz.

Potem ga pustimo, da se posuši, pritrdi na vročini in barva z eno od teh metod, razloženih spodaj:

Dorner tehnika

1. V epruveti pripravite koncentrirano suspenzijo sporuliranega mikroorganizma v destilirani vodi in dodajte enak volumen filtriranega Kinyoun karbol fuksina.

2- Epruveto postavite v kopel z vrelo vodo za 5 do 10 minut.

3- Na čistem diapozitivu zmešajte kapljico prejšnje suspenzije s kapljico 10% vodne raztopine nigrosina, kuhano in filtrirano.

4- Na rahlo segrejte in posušite.

5- Preučite s ciljem 100X (potopitev).

Spore se obarvajo rdeče, bakterijske celice pa so videti skoraj brezbarvne na temno sivi podlagi.

Spremenjena tehnika Dornerja

1- Suspenzija sporuliranega mikroorganizma se razprostira na drsniku in pritrdi na vročini.

2- Vzorec je prekrit s trakom filtrirnega papirja, ki mu je dodan karbol fuksin. Barvilo segreva 5 do 7 minut s plamenom Bunsenovega gorilnika, dokler ne nastanejo hlapi. Nato papir odstranimo.

3- Pripravek speremo z vodo in nato osušimo z vpojnim papirjem.

4- Maz prekrijete s tankim filmom 10% nigrosina, z drugim drsnikom razmažite nigrosin ali iglo.

Obarvanost spor in bakterij je enaka tisti, ki je opisana v stanju tehnike.

Shaeffer - tehnika Fulton ali Wirtz-Conklin

1- Na sliki naredite lep razmaz z suspenzijo sporiranega mikroorganizma in pritrdite na segrevanje.

2- Drsnik prekrijte s 5% malahitno zeleno vodno raztopino (na drsnik lahko položite filtrirni papir).

3- Segrejte plamen Bunsenovega gorilnika, da sprostite hlape in odstranite plamen. Ponovite postopek 6 do 10 minut. Če raztopina malahitne zelene med postopkom izhlapi preveč, lahko dodate več.

4- Odstranite filtrirni papir (če je nameščen) in ga sperite z vodo.

5- Drsnik pokrijte z 0,5% vodnim safraninom 30 sekund (nekatere različice tehnike uporabljajo 0,1% vodni safranin in ga pustite 3 minute).

S to tehniko so spore videti zelene, bacili pa rdeči.

Pomanjkljivost je, da endospore mladih kultur ne obarvajo dobro, saj so videti izjemno bistre ali brezbarvne. Da bi se temu izognili, je priporočljivo uporabljati kulture 48-urne inkubacije.

Möellerjeva tehnika

1- Maza pokrijte s kloroformom 2 minuti.

2- Zavrzite kloroform.

3- 5 minut pokrijemo s 5% kromovo kislino.

4- Operite z destilirano vodo

5- List je prekrit s karbolnim fuksin-fenicado in je izpostavljen plamenu Bunsenovega gorilnika, dokler ne izpušča hlapov; nato se za nekaj trenutkov odstrani s plamena. Operacija se ponovi, dokler ne mine 10 minut.

6- Izperite z vodo.

7- Za razbarvanje uporabite kisli etanol (klorovodikov alkohol). To ostane 20 ali 30 sekund.

8- Operite z destilirano vodo.

9- kontrastatirajte tako, da 5 minut obložite list z metilen modro.

10- Operite z destilirano vodo.

11- Pustimo, da se posuši in vzorec se odnese v mikroskop.

Spore so videti rdeče, bacili pa modro. Pomembno je, da hlapov ne vdihujemo, saj so strupeni in dolgoročno lahko rakotvorni.

Spremenjena Möellerjeva tehnika brez toplote

Leta 2007 so Hayama in njegovi sodelavci ustvarili modifikacijo tehnike Möeller. Odpravili so korak segrevanja barvila in ga nadomestili z dodajanjem 2 kapljic površinsko aktivnega sredstva Tergitol 7 na vsakih 10 ml raztopine karbol fuksin-karbola. Dobili smo enake rezultate.

Prijave

Obarvanost spore zagotavlja zelo dragocene in koristne informacije za identifikacijo patogena, saj so njegova prisotnost, oblika, lega znotraj bacila in sposobnost deformacije vegetativne celice ali ne, podatki, ki lahko vodijo vrsto vključeni znotraj določenega žanra.

V tem okviru je vredno reči, da so spore lahko okrogle ali ovalne, da se lahko nahajajo v središču ali tudi v paracentralnem, subminalnem ali terminalnem položaju.

Diagram oblike in položaja endospor in eksospor

Primeri

- Clostridium difficile tvori ovalno sporo v terminalnem položaju, ki deformira bacilo.

- Spore Clostridium tertium so ovalne, ne deformirajo bacila in se nahajajo na terminalni ravni.

- Endospora Clostridium tetani je terminalna in deformira bacilo, kar daje videz bobničnice.

- Spore Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy in C. septicum so okrogle ali subterminalne ovalne in deformirajo bacilo.

- Endospora Clostridium sordelli je nameščen v osrednjem položaju z rahlo deformacijo.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA

Reference

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Predlog poenostavljene tehnike obarvanja bakterijskih sporov brez uporabe toplote - uspešna modifikacija Moellerjeve metode. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356–9.
2. Sodelavci Wikipedije. Moeller madež. Wikipedija, prosta enciklopedija. 3. november 2018, 03:28 UTC. Dostopno na: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Priročnik za mikrobiološke tehnike. Oddelek za temeljne vede Akademija za mikrobiologijo. Nacionalni politehnični inštitut.
4. "Endospore." Wikipedija, prosta enciklopedija. 25. februar 2018, 10:20 UTC 10. januar 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J in sodelavci. (2006). Delavsko osebje avtonomne skupnosti Extremadura. Posebni dnevni red Zvezek IV. Uredništvo MAD. Sevilja-Španija, str. 211–212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), specialistični laboratorijski tehnik, galicijska zdravstvena služba (SERGAS). Zbirka posebnega dnevnega reda 2. Uredništvo MAD. Sevilja-Španija, str. 79–80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Argentina. Uredništvo Panamericana SA