OBARVANJE KAPSULE: UTEMELJITEV IN TEHNIKE - BIOLOGIJA - 2025

Obarvanje kapsula je razlika tehniko barvanja, ki ima v lasti stres polisaharid strukturi, ki obdaja nekatere bakterije in kvasovke, imenovane kapsula. Uporablja se v kliničnih laboratorijih za pomoč pri diagnosticiranju nekaterih patologij, ki jih povzročajo kapsulirani mikroorganizmi.

Uporablja se tudi v učnih laboratorijih za prikaz te morfološke strukture študentom zdravstvene kariere, kot so: medicina, bioanaliza, zdravstvena nega ali citotehnologija.

Razmaz Klebsiella pneumoniae, obarvan s kapsulnim madežem. Indijska metoda s črnilom s safraninom. Vir: A.A.V

Obstaja več preprostih tehnik za dokazovanje prisotnosti kapsule v mikroorganizmih, ki jih imajo, to so: negativni madež, madež Anthony in varianta, ki združuje prejšnji dve.

Negativno obarvanje se uporablja predvsem v vzorcih CSF, kadar obstaja sum na prisotnost kvasovk Cryptococcus neoformans. Ta kvas je pogost vzrok meningitisa.

Ta tehnika uporablja nigrosin ali indijsko črnilo in temelji na ustvarjanju kontrasta med ozadjem pripravka in nepropustno kapsulo mikroorganizma. Ozadje postane temno, kapsula pa brezbarvna. Na ta način se razkrije ta struktura.

Glede tehnike Anthony lahko rečemo, da se večinoma uporablja v učnih laboratorijih za dokazovanje polisaharidne strukture pri bakterijah, kot so Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae in Neisseria meningitidis.

Uporaba te tehnike za diagnostične namene je zelo redka, saj obstajajo drugi rutinski testi, ki omogočajo identifikacijo teh mikroorganizmov.

Osnove

Kapsula je močna struktura polisaharidne narave. To ščiti mikroorganizme pred fagocitozo, zato je težko prodreti v strukturo.

Zato madeži na kapsulah temeljijo na kontrastu. Barvila obarvajo dno pripravka, medtem ko kapsula ostane brezbarvna.

Zato je s temi tehnikami kapsula enostavno prepoznavna. Če mikroorganizem nima kapsule, se s to vrsto obarvanja ne bo razlikovalo, ker bo vse obarvano v isto barvo.

Vse tehnike, ki se uporabljajo za barvanje kapsule, imajo enako podlago kljub uporabi različnih barvil in postopkov.

Tehnike par

-Anthony madež

Anthonyjev madež uporablja kristalno vijolično kot madež. To bo obarvalo bakterijsko telo in ozadje vijolično.

Po drugi strani se uporablja 20% bakrovega sulfata. Ta služi kot pralna raztopina, to pomeni, da odvečni vijolični kristal odstrani iz pripravka, zaradi česar kapsule postanejo prozorne, vendar brez bakterijskega telesa ali ozadja izgubi barvo.

materiali

- Iridescentno mleko.

- Zdrs.

- 1% vijolični kristal.

- 20% bakrov sulfat.

- optični mikroskop.

- Potopno olje.

Proces

Ta tehnika je sestavljena iz:

1. Gojite mikroorganizem v prelivajočem se mleku 36 ur.
2. Kapljico kulture položite na konec diapozitiva in zraven nje položite kapljico vijoličnega stekla, premešajte in razmažite s koncem drugega diapozitiva.
3. Zrak je suh in se ne segreva.
4. Izperite z 20% raztopino bakrovega sulfata in pustite, da se posuši na zraku.
5. Opazujte pod mikroskopom s potopnim ciljem. Poiščite proti koncu namaza.

Pomembno je, da toplote ne uporabljate niti za fiksiranje niti za sušenje, saj to poškoduje kapsulo. Prav tako ne umivajte z vodo.

Interpretacija

Iridescentno mleko je odlično gojišče, saj mikroorganizmom zagotavlja potrebna hranila za razvoj izrazite kapsule.

Po drugi strani bo prelivno mleko tvorilo debelo in kompaktno dno, ki bo obarvano vijolično skupaj z bakterijskim telesom, kapsula, ki obkroža mikroorganizem, pa bo ostala brezbarvna. Zato je okrog bakterijskega telesa opazen jasen halo.

Grafični prikaz na mikroskopskem opazovanju razmaza Klebsiella pneumoniae, obarvanega z Anthonyjevim madežem. Vir: Avtor mag. Marielsa Gil.

Prednost

To je preprosta tehnika izvedbe. Ne zahteva pritrjevanja.

Upoštevati je treba tudi, da se lahko uporabljajo tudi drugi gojišča, vendar je prednostno mlečno gojišče, ker ima prednost pri zagotavljanju vidnejših kapsul.

Slabosti

Gre za nekoliko bolj delovno intenzivno tehniko kot negativno obarvanje, njena vizualizacija pa zahteva čakanje, da se priprava popolnoma posuši.

-Negativno obarvanje

materiali

- drsni diapozitivi.

- gojišče z mikroorganizmom.

- kitajsko črnilo ali nigrosin.

- optični mikroskop.

- Fiziološka fiziološka raztopina.

Proces

Na pokrovček položite kapljico fiziološke fiziološke raztopine in raztopite majhen del mikrobne kulture. Pomembno je, da pripravek ni preveč gost. Nato položite kapljico kitajskega črnila ali nigrosina in premešajte.

Potem se pripravek položi nad pokrov, ne da bi prelila tekočina. Pod mikroskopom ga opazujemo tako, da se najprej osredotočimo na cilj 10X in nato preidemo na 40X.

Ta tehnika se lahko uporablja tudi neposredno na vzorcih CSF. To je, namesto da bi dali kapljico mikrobne kulture, kapljico CSF.

Prednost

Je preprosta metoda izvedbe in hkrati poceni. Ne potrebuje pritrditve ali sušenja pripravka.

Slabosti

Pomanjkljivost je ta, da ga je treba opazovati pod mikroskopom, preden se pripravek posuši, saj se mikroorganizmi v tem primeru strdijo, kar bo otežilo vizualizacijo.

Po drugi strani pa se lahko pojavijo lažni pozitivni rezultati, če je analitik neizkušen, saj so levkociti pogosto zamenjeni s kvasovkami.

Opazovanje kapsul s kvasovkami s kitajsko tehniko črnila ali nigrosina je treba obravnavati kot domnevno diagnozo Cryptococcus neoformans, dokler se ne dokaže s kulturo.

To je zato, ker obstajajo drugi kvasovke, ki bi lahko bili vzrok za meningitis in ne le Cryptococcus neoformans, kot so rodovi Candida in Rhodotorula, pa tudi druge vrste Cryptococcus.

Interpretacija

Če obstajajo kapsulirani mikroorganizmi, bomo opazili temno ozadje, v tekočini pa bodo plavala prozorna telesa, ki poudarjajo prisotnost kapsule.

Kapsula Cryptococcus neoformans, obarvana s kitajskim črnilom. Vir: Fotografska ponudba: Ponudniki vsebin: CDC / Dr. Leanor haley

-Indijska tehnika s črnilom

To tehniko lahko opravite tudi z nigrosinom. Gre za kombinacijo prej opisanih tehnik. Ta tehnika uporablja kristalno vijolično in indijsko črnilo ali nigrosin.

Telo bakterij se iz kristalno vijolične obarva vijolično, ker je negativno nabit, nigrosin pa obarva dno razmaza. Če ima bakterija kapsulo, se bo ta pojavila kot prozoren halo okoli mikroorganizma.

Kristalno vijolično lahko nadomestite s katero koli od teh barv: safranin, osnovni fuksin ali metilen modro.

materiali

- Vijolično steklo.

- Nigrosin ali indijsko črnilo.

- drsni diapozitivi.

- Mikroskop.

Proces

- Gojite mikroorganizem v gojišču.

- Na drsnik položite kapljico kulture in poleg nje položite kapljico indijskega črnila ali kristala nigrosina, premešajte in razmažite s koncem drugega diapozitiva.

- Zrak se posuši in ne pritrdi na toploto.

- 1 minuto pokrijemo z vijolično kristalno raztopino, operemo z destilirano vodo, vendar zelo nežno (mehak curek), pustimo, da se posuši na prostem.

- Opazujte pod mikroskopom s potopnim ciljem. Poiščite proti koncu namaza.

Interpretacija

Videlo bo vijolično bakterijsko telo in temno ozadje. Če je kapsula, bo okoli bakterij videti brezbarvna.

Reference

1. Covadonga A, Silóniz M, Serrano S. Osnovne tehnike mikrobiologije. Opazovanje bakterij. Reduka (biologija). Mikrobiološka serija. 2010; 3 (5): 15–38. D
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Osnovni madeži v mikrobiološkem laboratoriju. Mediagraphic.org. 2014; 3 (1): 10–18. Dostopno na: medigraphic.com
3. Gil M. Negativno obarvanje: utemeljitev, tehnika, prednosti in slabosti. Lifeder.com.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Argentina. Uredništvo Panamericana SA
5. Tankeshwar A. Kapsulski madež: načelo, postopek in rezultati. 2019. Medicinski vodnik za mikrobiologijo. Na voljo na: microbeonline.com