VOGES-PROSKAUER TEST: TEMELJ, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Test Voges-Proskauer je biokemijski test, ki se uporablja za pomoč pri identifikaciji bakterij iz družine Enterobacteriaceae. Zlasti je koristen za razlikovanje sevov bakterije Escherichia coli od Klebsiella in Enterobacter.

Preizkus se izvede v tekočem gojišču z imenom Methyl Red - Voges Proskauer, bolj znanem po akronimu RM / VP. Ta medij je sestavljen iz puferiranega polipeptona, glukoze, dikalijevega fosfata in destilirane vode.

Tržni medij Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) je pozitiven in negativen. Vir: Fotografijo avtor mag. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, z Wikimedia Commons

Trenutni medij RM / VP je modifikacija medija Clark in Lubs, ki je prvotno vseboval nižjo koncentracijo peptonov in glukoze. Tako je nastalo manj vodikovega iona, potrebnega za pozitivno Voges-Proskauerjevo reakcijo.

Test temelji na sposobnosti mikroorganizma, da uporablja glukozo po poti butilen-glikola in tvori nevtralen končni produkt, imenovan acetoin, v prisotnosti kisika in alkalnega pH.

V mediju RM / VP lahko poleg razkritja Voges-Proskauerjevega testa razkrijemo tudi metilno rdeč test.

Osnove

Voges-Proskauer testna osnova

Prisotni pluripeptoni v gojišču zagotavljajo bistvene prehranske potrebe za rast bakterij. Glukoza je glavna sestavina. Mnoge bakterije imajo sposobnost presnove glukoze in tvorijo piruvično kislino.

Pirovična kislina je sredina v presnovi glukoze in od tod lahko vsak mikroorganizem po različnih poteh. Nekateri tvorijo mešane kisline, kot so mlečna kislina, ocetna kislina, mravljična kislina in jantarna kislina, drugi pa tvorijo nevtralne produkte, kot je 2,3-butandiol.

Voges-Proskauerjev test razkriva sposobnost mikroorganizma, da v aerobnih pogojih tvori acetil metil karbinol (acetoin), vmesni produkt 2,3-butandiola.

Acetoin se zmanjša in tvori 2,3-butandiol, vendar je ta reakcija reverzibilna, zato če 2,3-butandiol oksidira, nastane acetoin. Zato je kisik bistvenega pomena.

Dikalijev fosfat je pufer, ki mešanico puferira pri pH 6,9 ± 0,2.

Podlaga za razkritje dokazov in razlago

Za prikaz reakcije je treba izvesti razvoj z uporabo dveh reagentov (Barrit reagenti), znanih kot Voges A in Voges B.

Voges A je 5% raztopina α-naftola, Voges B pa je 40-odstotni pripravek kalijevega hidroksida. Če kalijevega hidroksida ni na voljo, ga lahko nadomestite s 40% natrijevim hidroksidom.

Α-naftol je katalizator, ki poveča intenzivnost reakcijske barve, zaradi česar je test bolj občutljiv. Α-naftol je treba vedno najprej dodati, tako da stresamo cev, da pride medij v stik s kisikom. Na ta način se prisoten acetoin oksidira v diacetil in 2,3-butandiol oksidira, da tvori acetoin, in ta prenese v diacetil.

Tako se bo α-naftol vezal na diacetil, ki se je pridružil jedru gvanidina, ki je prisoten v aminokislini arginin, pri čemer slednji prihaja iz pluripeptonov.

Kalijev ali natrijev hidroksid je odgovoren za absorpcijo CO ₂ in reagiranje s peptoni. Ta reakcija povzroči nastanek lososo-rožnate barve, ki je jasno vidna po zelo dobrem pretresanju cevi.

Prave količine diacetila, peptona in α-naftola je treba mešati, da se barva pojavi takoj. Če se to ne zgodi, pustite epruveto, da počiva 15 minut pred tolmačenjem.

Test je ponavadi pozitiven po 2 do 5 minutah, ko je mogoče videti rahlo rožnato barvo. Če pustimo stati 30 minut do 1 ure, bo intenzivnost barve največja (intenzivno rdeča).

Ko se juha obarva rumeno, se prikaže negativni test. Če je test negativen, se lahko po 1 uri obarva baker kot posledica reakcije kalijevega hidroksida na α-naftol.

Priprava

Srednja MR / VP

Natehtamo 17 g dehidriranega gojišča in raztopimo v litru destilirane vode. Pustite stati 5 minut. Segrejemo do vretja, da se popolnoma raztopi. V epruvetah odmerite 3 do 4 ml in sterilizirajte v avtoklaviranju pri 121 ° C 15 minut.

Dehidrirano gojišče je bež barve, pripravljen medij pa je svetlo jantarne barve.

Končni pH medija je 6,9 ​​± 0,2.

Voges reagent

Odtehtamo 5 g α-naftola in raztopimo v 50 ml etilnega alkohola (absolutno). Nato nadaljujte z dodajanjem etilnega alkohola, dokler ne doseže 100 ml.

Reagent Voges B

Odtehtamo 40 g kalijevega hidroksida in ga v čaši raztopimo v 50 ml destilirane vode. Kozarec je treba postaviti v hladno vodno kopel za nadzor temperature, ker se pri raztapljanju pripravka temperatura močno dvigne.

Ko je raztopina hladna, se prenese v prostorninsko bučko in dopolni do 100 ml z destilirano vodo.

Voges-Proskauerjev preskusni postopek

Za izvedbo testa Voges-Proskauer se v študijsko mikroorganizem iz čiste kulture od 18 do 24 ur inokulira juha z RM / VP.

Inokulum ne sme biti zelo gost. Inkubiramo ga pri 35-37 ° C 24 do 48 ur, čeprav je včasih potrebno nekajdnevno inkubacijo. Cowan in Steel menita, da je 5 dni najmanjši čas inkubacije, potreben za odkrivanje vseh pozitivnih vrst Voges-Proskauer (VP) iz družine Enterobacteriaceae.

Razvoj testa

V epruveto ločite 1 ml alikvota in razvijte na naslednji način: 12 kapljic (0,6 ml) Vogesa reagenta in 4 kapljice (0,2 ml) Vogesa B. zmešajte, da zračite in pustite, da se naseli. 5 - 10 minut pred tolmačenjem. Če pa je test še vedno negativen, ga pustite sedeti in opazujte epruveto po 30 minutah do 1 uri.

Videz rožnato-rdeče barve kaže, da je reakcija Voges-Proskauer pozitivna. Če medij ostane rumen, je reakcija negativna.

Dodajanje razvijalcev v navedenem vrstnem redu in količini je nujno, da se izognete lažnim negativnostim.

Uporaba

Test Voges-Proskauer je koristen za razlikovanje med sevi E. coli, ki so negativni na VP, iz rodov Klebsiella, Enterobacter, Serratia, ki so pozitivni na VP.

Vir: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.

QA

Kontrolni sevi se lahko uporabijo za testiranje kakovosti pripravljenega gojišča, vključno z Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium in Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Pričakovani rezultati so pozitivni Voges-Proskauer reakcije samo za K. pneumoniae in E. cloacae. Ostali povzročajo negativne reakcije.

Reference

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015. Dostopno na: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-identiteta Vogesa Proskauerja. 2014. Dostopno: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testi za identifikacijo bakterij kliničnega pomena. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires Argentina.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.