PROTEINAZA K: ZNAČILNOSTI, ENCIMSKA AKTIVNOST, APLIKACIJE - BIOLOGIJA - 2026

Proteinaze K je encim, ki spada v skupino serinskih proteaz, in sicer, da ima v svojem srednjem katalitsko aktivna serin aminokislin in ima funkcijo rešuje peptidnih vezi s hidrolizo. Ta encim spada v družino proteinov subtilisina (peptidaza S8).

Proteinaza K ima molekulsko maso (MW) 28.900 daltonov in je bila prvič izolirana leta 1974 v izvlečkih glive album Engyodontium, prej znane kot Tritirachium album Limber.

Molekularna struktura proteinaze K. Vir: Lykchiniadis

Ima visoko proteolitično sposobnost, kar dokazuje s tem, da lahko razgradi prisotni keratin v laseh. Beseda keratin v angleščini piše "keratin", od tod se imenuje "proteinaza K".

Ta encim je zaradi svoje velike moči cepitve avtohtonih beljakovin uporaben v različnih tehnikah molekularne biologije. Uporablja se predvsem za izolacijo in pripravo nukleinskih kislin z visoko molekulsko maso (MW).

Proteinaza K deluje tako, da sprošča jedrsko DNK, hkrati pa uničuje beljakovine in inaktivira RNaze in DNaze, torej odstranjuje nukleaze v preparatih DNA in RNA.

Po drugi strani je bilo ugotovljeno, da proteinaza K lahko hidrolizira nekatere denaturirane domače beljakovine, kar je vzbudilo zanimanje raziskovalcev za njeno uporabo pri preučevanju prionskih beljakovin (PrPC).

Kljub visoki proteolitični učinkovitosti pa obstajajo proteini, ki so odporni na delovanje proteinaze K. Med njimi je nekaj nenormalnih beljakovin, imenovanih prioni (PrPSc), povezanih s transmisivno spongiformno encefalopatijo.

Značilnosti proteinaze K

Proteinaza K ima terciarno strukturo, sestavljeno iz treh slojev, s sedem verigo β pločevine, nameščene med dvema slojema vijačnic. Ker spada v družino peptidaz S8, je značilno, da ima na svojem aktivnem mestu katalitično triado, katere zaporedni vrstni red je (Asp, His in Ser), ki jih razlikuje od drugih družin peptidaz.

Za ta encim iz skupine serinskih proteaz je značilno, da hidrolizirajo peptidne vezi blizu karboksilne skupine alifatskih in aromatskih aminokislin.

Po drugi strani lahko deluje v prisotnosti nekaterih jedkih snovi, kot so natrijev dodecil sulfat (SDS), Tris-HCL in EDTA, ki se uporabljajo za pomoč pri denaturaciji beljakovin, zaradi česar izgubijo svojo domačo strukturo.

To je predhodni korak pri pripravi beljakovin za tehniko elektroforeze. Razpon pH, na katerega deluje proteinaza K, je precej širok (2,0 do 12,0), z optimalnim pH med 7,5 in 12,0, njegova izelektrična točka pa je 8,9. Kot je razvidno, je aktiven v zelo širokem območju pH.

Druga značilnost, ki izstopa pri proteinazi K, je njena stabilnost v prisotnosti visokih temperatur (50 - 60 ° C).

Encimatska aktivnost

Proteinaza K zahteva prisotnost kalcijevega iona, čeprav to ne vpliva na njegovo aktivnost, če je ključnega pomena za ohranjanje njegove stabilnosti.

Da proteinaza K lahko substrat v celoti prebavi, je potreben kontaktni čas približno 5 minut do 2 uri.

Vendar pa sta v tem smislu Daza in sod. Primerjali čistost DNK, pridobljeno ob različnih obdobjih izpostavljenosti proteinazi K, in ugotovili, da dolgotrajna inkubacija (do 24 ur) znatno izboljša kakovost DNK.

Glede koncentracije encima proteinaze K, ki se uporablja v različnih protokolih, pa lahko rečemo, da je zelo raznolik.

Uporablja se lahko od zelo nizkih koncentracij (5 µg / ml) do koncentracij 500 µg / ml. Toda najpogostejše delovne koncentracije se gibljejo med 50–100 µg / ml, zlasti za prebavo beljakovin in inaktivacijo nukleusa. Čeprav je za zdravljenje tkiv potrebna koncentracija 2 mg / ml.

Prijave

Njegove uporabe so zelo široke in jih je mogoče povzeti na naslednji način:

- Uporablja se pri prebavi beljakovin in črpanju DNA z različnimi metodami, kot so: soljenje, PK-SDS, cetil-trimetil amonijev bromid (CTAB), modificiran kalijev acetat in ekstrakcija z natrijevim jodidom.

-Aktivacija nukleaz (RNaze in DNaze).

-V tehniki hibridizacije in situ (HIS), da se poleg izločanja neželenih beljakovin pomaga sproščanje nukleinske kisline.

-Modifikacija beljakovin.

-Na ravni raziskav v različnih študijah.

Prednosti proteinaze K

Med tehnikami ekstrakcije DNK, ki uporabljajo proteinazo K, je bilo izvedenih več primerjalnih študij z drugimi, ki tega ne uporabljajo, in vsi sklepajo, da so večje koristi od uporabe encima. Prednosti vključujejo naslednje:

-DNA visoke molekularne mase, visoke kakovosti in čistosti

- Izvlečena DNK je stabilna do 3 mesece.

Izvlečeno DNK lahko uporabimo v naslednjih tehnikah: Southern blot, verižna reakcija polimeraze (PCR), elektroforeza, med drugim.

Proteini, odporni na beljakovine

Različne raziskave so zaključile, da se prioni (nenormalno strupeni PrPSc proteini) razlikujejo od prPC (domačih) beljakovin po odpornosti proti delovanju proteinaze K, medtem ko so PrPC občutljivi na njeno delovanje.

Drugi avtorji so opisali, da v strukturi PrPSc obstajajo občutljivi deli in drugi, odporni na proteinazo K. Vendar sta oba dela enako strupena in nalezljiva.

Po drugi strani so Bastian et al. Leta 1987 iz vrste Spiroplasma mirum izolirali 4 beljakovine 28, 30, 66 in 76 kda. Za vse je bilo ugotovljeno, da so odporni proti delovanju proteinaze K in so imeli tudi navzkrižno reakcijo z nekaterimi prioni.

Znano je, da lahko ta vrsta povzroči katarakto in pomembno nevrološko škodo, zaradi Bastianovih znanstvenih ugotovitev pa so med drugimi preiskavami poskusili povezati ta mikroorganizem s prenosljivo spongiformno encefalopatijo.

Vendar se etiologija te degenerativne nevrološke patologije še danes pripisuje prionom.

V tem smislu so Butler in sod. Leta 1991 iz dveh sevov bakterije Mycoplasma hyorhinis identificirali in označili razred beljakovin, odpornih na proteinazo K, 40 kda. Ta patogen vpliva na prašiče in okuži njihova tkiva, vendar v tem primeru ni bilo navzkrižne reakcije s testiranimi prioni.

Za rešitev mnogih neznank v zvezi s tem je potrebnih več raziskav.

Reference

1. Bastian F, Jennings R in Gardner W. 1987. Antiserum na fibrilski protein, povezan s praskami, navzkrižno reagira s proteini Spiroplasma miru m fibril. J. Clin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Ocena metode ekstrakcije in čiščenja DNK iz mišičnega tkiva, fiksiranega s formaldehidom, neidentificiranega trupla. Revija Med, 2014; 22 (1): 42–49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E in Mcgarrity G. Identifikacija in karakterizacija proteinov, odpornih na proteine, v članih razreda Mollicutes. Infekcija in imuniteta, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L in sod. Primerjava dveh protokolov ekstrakcije DNA Trypanosoma cruzi, gojenih v aksenskem mediju. Rev. Peru. Med., Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222–227. Dostopno na: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E in Palma W. Določitev učinkovitosti petih protokolov ekstrakcije DNK iz parafiniranega materiala za molekularne študije. Rev Méd Univ Kostarika. 2007; 1 (1): 10-19.