ENDONUCLEASES: FUNKCIJE, VRSTE IN PRIMERI - BIOLOGIJA - 2025

V endonukleazami so encimi, ki zadevajo fosfodiesterske vezi, ki se nahajajo znotraj nukleotidne verige. Mesta za omejitev endonuclease so zelo raznolika. Nekateri od teh encimov režejo DNK (deoksiribonukleinska kislina, naš genetski material) skoraj povsod, torej niso nespecifični.

Nasprotno pa obstaja še ena skupina endonuklez, ki so v regiji ali zaporedju, ki ga je treba cepiti, zelo specifične. Ta skupina encimov je znana kot restrikcijski encimi in so zelo koristni v molekularni biologiji. V tej skupini imamo dobro znane encime Bam HI, Eco RI in Alu I.

Endonuklease notranje režejo DNK.
Vir: pixabay.com

V nasprotju z endonukleazami obstajajo še ena vrsta katalitičnih beljakovin - eksonukleaze - ki so odgovorne za pretrganje fosfodiesterskih vezi na koncu verige.

Omejevalna endonukleaza

Restriktivni endonukleazi ali restrikcijski encimi so katalitični proteini, ki so odgovorni za cepljenje fosfodiesterskih vezi znotraj verige DNA v zelo specifičnih zaporedjih.

Te encime lahko kupimo pri več podjetjih, ki se ukvarjajo z biotehnologijo, njihova uporaba pa je skorajda nujna v trenutnih tehnikah manipulacije z DNK.

Restriktivne endonukleze se poimenujejo s pomočjo prvih črk binomnega znanstvenega imena organizma, iz katerega so prišle, sledijo sevi (ta ni obvezen) in končajo s skupino restrikcijskih encimov, ki jim pripadajo. Na primer, Bam HI in Eco RI se pogosto uporabljata endonukleaze.

Območje DNK, ki ga encim prepozna, se imenuje mesto restrikcije in je edinstveno za vsako endonukleazo, čeprav se lahko na mestih restrikcije sovpada več encimov. To mesto na splošno sestavlja kratko palindromsko zaporedje v dolžini približno 4 do 6 baznih parov, kot sta AGCT (za Alu I) in GAATTC za Eco RI.

Palindromske sekvence so zaporedja, ki so, čeprav se berejo v smeri 5 'do 3' ali 3 'do 5', identična. Na primer, v primeru Eco RI je palindromsko zaporedje: GAATTC in CTTAAG.

Funkcije in aplikacije restrikcijskih endonukle

Na srečo molekularnih biologov so bakterije med evolucijo razvile vrsto restrikcijskih endonukliz, ki notranje drobijo genetski material.

V naravi so se ti encimi razvili - predvidoma - kot bakterijski zaščitni sistem pred vdorom tujih molekul DNK, kot so tisti iz fagov.

Za razlikovanje med domačim in tujim genskim materialom lahko te restrikcijske endonukleze prepoznajo specifična nukleotidna zaporedja. Tako lahko DNK, ki nima tega zaporedja, znotraj bakterij nemoteno moti.

Ko pa endonukleaza prepozna mesto restrikcije, se veže na DNK in ga razreže.

Biologe zanima študij genetskega materiala živih bitij. Vendar pa DNK sestavlja več milijonov baznih parov v dolžino. Te molekule so izjemno dolge in jih je treba analizirati v majhnih drobcih.

Za dosego tega cilja so restrikcijski endonuklezi vključeni v različne protokole molekularne biologije. Na primer, posamezen gen lahko zajamemo in ponovimo za prihodnjo analizo. Ta postopek imenujemo "kloniranje" gena.

Polimorfizem dolžine ločilnega fragmenta (RFLP)

Polimorfizmi dolžine restriktivnih fragmentov se nanašajo na vzorec specifičnih nukleotidnih zaporedij v DNK, ki jih lahko prepoznajo in razrežejo restrikcijske endonukleze.

Zaradi specifičnosti encimov je za vsak organizem značilen poseben rezalni vzorec v DNK, ki izvirajo delci spremenljive dolžine.

Vrste restrikcijskih endonuklij

V preteklosti smo restrikcijske endonukleze razvrstili v tri vrste encimov, ki jih označujejo rimske številke. Nedavno je bila opisana četrta vrsta endonukleaze.

Tip I

Najpomembnejša značilnost endonuklez tipa I je, da so beljakovine sestavljene iz več podenot. Vsaka od teh deluje kot en sam proteinski kompleks in ima običajno dve podenoti, imenovani R, dve M in ena S.

S del je odgovoren za prepoznavanje restrikcijskega mesta v DNK. Podenota R je namreč pomembna za cepitev in M ​​je odgovoren za kataliziranje reakcije metilacije.

Obstajajo štiri podkategorije encimov tipa I, znanih po črkah A, B, C in D, ki so v skupni rabi. Ta razvrstitev temelji na genskem dopolnjevanju.

Encimi tipa I so bili prvi restrikcijski endonuklezi, ki so bili odkriti in očiščeni. Najbolj uporabni v molekularni biologiji pa so tip II, ki bo opisan v naslednjem razdelku.

Tip II

Endonukleaze tipa II prepoznajo specifične sekvence DNA in se cepijo v konstantnem položaju blizu zaporedja, ki proizvaja 5 'fosfate in 3' hidroksile. Kot kofaktorje običajno potrebujejo magnezijeve ione (Mg ²⁺ ), vendar obstajajo nekateri, ki imajo veliko bolj posebne zahteve.

Strukturno se lahko pojavijo kot monomeri, dimeri ali celo tetrameri. Rekombinantna tehnologija uporablja endonukleaze tipa II in zato je bilo značilnih več kot 3.500 encimov.

Tip III

Ti encimski sistemi so sestavljeni iz dveh genov, imenovanih mod in res, ki kodirata podenote, ki prepoznavajo DNK, in za spremembe ali omejitve. Obe podenoti sta potrebni za omejitev, postopek, ki je popolnoma odvisen od hidrolize ATP.

Za cepitev molekule DNK mora encim medsebojno delovati z dvema kopijama ne-palindromskega prepoznavnega zaporedja, mesta pa morajo biti na substratu obrnjena. Pred cepitvijo sledi translokacija DNK.

Tip IV

V zadnjem času je bila ugotovljena dodatna skupina. Sistem je sestavljen iz dveh ali več genov, ki kodirajo beljakovine, ki cepijo le spremenjena zaporedja DNA, bodisi metiliranega, hidroksimetiliranega ali hidrometiliranega glukozila.

Encim EckKMcrBC na primer prepozna dva dinukleotida splošne oblike RmC; purin, ki mu sledi metilirani citozin, ki ga lahko ločimo z več baznimi pari - od 40 do skoraj 3000. Cepitev poteka približno 30 baznih parov po mestu, ki ga encim prepozna.

Endonukleaze V

Endonukleaze te vrste so znane tudi kot "domače" endonukleze. Ti encimi prepoznajo in presečejo ciljno zaporedje DNK na edinstvenih mestih v genomu od 14 do 40 bp.

Ti encimi so pogosto kodirani v intronih in verjamejo, da je njihova funkcija spodbujanje horizontalnega prenosa reznih sekvenc. Po rezanju pride do popravka prekinitve v dvojni vijačnici DNK, ki temelji na komplementarnem zaporedju.

Primeri

Endonuclease I iz E. coli deluje kot obrambni sistem pred fagi in zajedavci. Nahaja se predvsem med citoplazemsko membrano in celično steno. Proizvaja dvokrake prelome v tuji DNK, s katerimi komunicira v periplazemskem prostoru.

Endonukleaze CRISPR-Cas so encimi, ki delujejo na obrambni mehanizem številnih vrst bakterij. Ti identificirajo in odrežejo specifične sekvence DNA iz invazivnih organizmov, ki so na splošno virusi.

Pred kratkim so raziskovalci z Massachusetts Institute of Technology (MIT) odkrili sistem za urejanje genoma CRISPR-Cas12bm z visoko natančnostjo za modifikacijo človeških celic.

Reference

1. Burrell, MM (ur.). (1993). Encimi molekularne biologije. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA in Wilson, GG (2013). Omejevalni encimi tipa I in njihovi sorodniki. Raziskave nukleinskih kislin, 42 (1), 20–44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, in Pfaller, MA (2017). Medicinska mikrobiologija + StudentConsult v španščini + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriktivna endonukleaza pri analizi in prestrukturiranju molekul DNK. Letni pregled biokemije, 44 (1), 273–293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Endonukleaze tipa II restrikcije: struktura in mehanizem. Celične in molekularne vede o življenju, 62 (6), 685.