VISOKOZMOGLJIVA TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA (HPLC): UTEMELJITEV, OPREMA, VRSTE - KEMIJA - 2025

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti je ključnega pomena tehnike, uporabljene na kemijske analize, ki so dovoljeni ločene zmesi, očisti in količinsko njegovih komponent, ter nadaljnje študije. Znana je po kratici HPLC, ki izhaja iz angleščine: High Performance Liquid Chromatography.

Tako, kot že ime pove, deluje z manipulacijo s tekočinami. Vsebujejo mešanico, sestavljeno iz analita ali vzorca, ki vas zanima, in enega ali več topil, ki delujejo kot mobilna faza; torej tisto, ki analit vleče skozi vso HPLC opremo in stolpec.

HPLC oprema. Vir: Dqwyy

HPLC pogosto uporabljajo laboratoriji za analizo kakovosti v številnih podjetjih; kot so zdravila in hrana. Zadevni analitik mora pripraviti vzorec, premično fazo, preveriti temperaturo in druge parametre ter viale postaviti v kolo ali vrtiljak, da oprema samodejno izvede injekcije.

Oprema HPLC je povezana z računalnikom, prek katerega je mogoče opazovati ustvarjene kromatograme, pa tudi zagnati analize, nadzorovati hitrost pretoka mobilne faze, programirati vrsto elucije (izokratično ali gradientno) in vklopiti detektorje (UV -Vis ali masni spektrofotometer).

Osnove

Za razliko od običajne tekoče kromatografije, kot je kromatografija napolnjena s papirjem ali silikagelom, HPLC ni odvisna od gravitacije, da tekočina zmoči stacionarno fazo. Namesto tega deluje z visokotlačnimi črpalkami, ki mobilno fazo ali eluent skozi kolono namakajo z večjo intenzivnostjo.

Na ta način ni potrebno, da se mobilna faza vsake toliko časa preliva skozi stolpec, ampak sistem to izvaja neprekinjeno in z večjimi pretoki.

Toda učinkovitost te tehnike ni posledica izključno te podrobnosti, temveč tudi drobnih delcev polnila, ki sestavljajo stacionarno fazo. Če je manjši, je njegovo območje stika z mobilno fazo večje, zato bo bolje delovalo z analitom in njegove molekule se bodo bolj ločile.

Zaradi teh dveh značilnosti in dejstva, da tehnika omogoča spajanje detektorjev, je HPLC veliko boljši od tankoslojne ali papirne kromatografije. Ločevanja so učinkovitejša, mobilna faza potuje bolje skozi stacionarno fazo in kromatogrami lahko zaznajo kakršno koli napako v analizi.

Oprema

Poenostavljeni diagram delovanja opreme HPLC. Vir: Gabriel Bolívar.

Zgoraj je poenostavljen diagram delovanja HPLC opreme. Topila so v svojih posodah, razporejenih s cevmi, tako da črpalka odnese majhno količino le-teh v opremo; tako imamo mobilno fazo.

Najprej je treba razpliniti mobilno fazo ali eluent, tako da mehurčki ne vplivajo na ločitev molekul analita, ki se pomeša z mobilno fazo, ko oprema opravi injekcije.

Kromatografski stolpec je nameščen znotraj pečice, ki omogoča uravnavanje temperature. Tako za različne vzorce obstajajo ustrezne temperature za doseganje visokozmogljivih ločitev, pa tudi širok katalog stolpcev in vrst polnil ali stacionarnih faz za specifične analize.

Mobilna faza z raztopljenim analitom vstopi v kolono in iz nje se najprej izlužijo molekule, ki »čutijo« manj afinitete do stacionarne faze, medtem ko se tiste, ki jih ta zadrži, bolj eluirajo. Vsaka eluirana molekula ustvari signal, prikazan na kromatogramu, kjer opazimo retencijske čase ločenih molekul.

Po drugi strani pa se mobilna faza po prehodu skozi detektor konča v posodi za odpadke.

Vrste HPLC

Obstaja veliko vrst HPLC, a med vsemi najbolj izstopajo naslednje štiri.

Normalna kromatografija

Normalna fazna kromatografija se nanaša na tisto, kjer je stacionarna faza polarna, mobilna faza pa je nepolarna. Čeprav se imenuje normalno, se v resnici najmanj uporablja, pri čemer je obratna faza najbolj razširjena in učinkovita.

Reverznofazna kromatografija

Ker je inverzna faza, je stacionarna faza apolarna, mobilna pa polarna. To je še posebej koristno pri biokemijskih analizah, saj se veliko biomolekul bolje raztopi v vodi in v polarnih topilih.

Ionska izmenjevalna kromatografija

Pri tej vrsti kromatografije se analit s pozitivnim ali negativnim nabojem premika skozi steber in nadomešča ione, v katerih se nahaja. Večji kot je naboj, večje je njegovo zadrževanje, zato se pogosto uporablja za ločevanje ionskih kompleksov prehodnih kovin.

Kromatografija za izključitev velikosti

Ta kromatografija je namesto ločevanja zadolžena za čiščenje nastale zmesi. Kot pove že njegovo ime, analit ločimo ne več glede na to, kako tesno je povezan s stacionarno fazo, temveč glede na njegovo velikost in molekulske mase.

Manjše molekule se bodo zadržale bolj kot velike molekule, saj se slednje ne ujamejo med pore polnil polimernih stolpcev.

Prijave

HPLC omogoča kvalitativno in kvantitativno analizo. S kvalitativne strani lahko s primerjavo časov zadrževanja kromatograma pod določenimi pogoji ugotovimo prisotnost določene spojine. Takšna prisotnost lahko kaže na bolezen, prešuštvo ali uživanje drog.

Zato je računalniški del diagnostičnih laboratorijev. Prav tako ga najdemo v farmacevtski industriji, saj omogoča preverjanje čistosti izdelka in njegove kakovosti glede raztapljanja v želodčnem okolju. Začetne materiale podvržemo tudi HPLC, da jih očistimo in zagotovimo boljše delovanje pri sintezi zdravil.

HPLC omogoča analizo in ločevanje kompleksnih mešanic beljakovin, aminokislin, ogljikovih hidratov, lipidov, porfirinov, terpenoidov in je v bistvu odlična možnost za delo z rastlinskimi ekstrakti.

In končno, molekularna izključitvena kromatografija omogoča izbiro polimerov različnih velikosti, saj so nekateri lahko manjši ali večji od drugih. Na ta način dobimo izdelke z nizko ali visoko povprečno molekularno maso, ki so odločilni dejavnik njihovih lastnosti in prihodnje uporabe ali sinteze.

Reference

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Kvantitativna analitična kemija. (peta izd.). Dvorana PEARSON Prentice.
2. Bussi Juan. (2007). Visokozmogljiva tekočinska kromatografija. . Pridobljeno: fing.edu.uy
3. Wikipedija. (2019). Visokozmogljiva tekočinska kromatografija. Pridobljeno: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Tekoča kromatografija visoke ločljivosti. Pridobljeno: chemguide.co.uk
5. Matej Barkovič. (05. decembra 2019). Tekoča kromatografija visoke ločljivosti. Kemija LibreTexts. Pridobljeno: chem.libretexts.org
6. GP Thomas. (15. april 2013). Tekoča kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) - metode, koristi in aplikacije. Pridobljeno: azom.com