ZIEHL-NEELSEN MADEŽ: UTEMELJITEV, REAGENTI IN TEHNIKA - BIOLOGIJA - 2026

Ziehl-Neelsen barvilnega tehnika za identifikacijo mikroorganizmi odporno alkohola kislino (ARA). Ime tega mikrobiološkega postopka se nanaša na njegove avtorje: bakteriolog Franz Ziehl in patolog Friedrich Neelsen.

Ta tehnika je vrsta diferencialnega obarvanja, ki pomeni uporabo različnih barvil, da bi ustvarili kontrast med strukturami, ki jih želite opazovati, razlikovati in pozneje prepoznati. Madež Ziehl-Neelsen se uporablja za identifikacijo nekaterih vrst mikroorganizmov.

Ziehl-Neelsen madež

Nekateri od teh organizmov so mikobakterije (npr. Mycobacterium tuberculosis), nokardija (npr. Nocardia sp.) In nekateri enocelični zajedavci (npr. Cryptosporidium parvum). Veliko bakterij lahko razvrstimo s skupno tehniko, imenovano Gram madež.

Vendar pa nekatere bakterijske skupine potrebujejo druge metode, da jih lahko prepoznajo. Za tehnike, kot je madež Ziehl-Neelsen, so potrebne kombinacije barvil s toploto, da se pritrdi prvo na celično steno.

Nato sledi postopek beljenja, ki omogoča dva rezultata: odpornost ali občutljivost na razbarvanje s kislinami in alkoholi.

Osnove

Obrazložitev te tehnike obarvanja temelji na lastnostih celične stene teh mikroorganizmov. Steno sestavlja vrsta maščobnih kislin, imenovanih mikolične kisline; Za njih je značilno, da imajo zelo dolge verige.

Kadar imajo maščobne kisline zelo dolge strukture, lahko lažje zadržijo barvila. Nekatere bakterijske rodove je zaradi velike vsebnosti mikoličnih kislin v celični steni zelo težko obarvati po Gramu.

Na madežu Ziehl-Neelsen se uporablja fenolna spojina karbol fuksin, osnovni madež. Ta ima sposobnost interakcije z maščobnimi kislinami celične stene, ki je voskaste teksture pri sobni temperaturi.

Obarvanje s karbolnim fuksinom se poveča v prisotnosti toplote, ker se vosek stopi in molekule barvila se hitreje premikajo v celično steno.

Kislina, ki se kasneje uporabi, služi za razbarvanje celic, ki niso bile obarvane, ker njihova stena ni bila dovolj povezana z barvilom; zato je moč kislega belila sposobna odstraniti kislo barvilo. Celice, ki se upirajo tej spremembi barve, imenujemo hitro kisline.

Sekundarno barvilo

Po razbarvanju vzorca je v nasprotju z drugim barvilom, imenovanim sekundarno barvilo. Na splošno se uporabljajo metilen modra ali malahit zelena.

Sekundarno barvilo obarva material ozadja in posledično ustvarja kontrast strukturam, ki so bile obarvane v prvem koraku. Le razbarvane celice absorbirajo drugo barvilo (protitelesa) in prevzamejo njihovo barvo, medtem ko celice, ki hitro delujejo na kislini, ohranijo svojo rdečo barvo.

Ta postopek se pogosto uporablja za identifikacijo Mycobacterium tuberculosis in Mycobacterium leprae, ki se imenujeta hitro kislinske bacile.

Reagenti

Primarno barvilo

Uporablja se 0,3% karbolni fuksin (filtriran). To barvilo pripravimo iz mešanice alkoholov: fenola v etanolu (90%) ali metanolu (95%) in v tej mešanici raztopimo 3 grame osnovnega fuksina.

Raztopina za beljenje

V tem koraku lahko uporabimo raztopine 3% alkoholne kisline ali 25% žveplove kisline.

Sekundarno barvilo (kontra-barvilo)

Barvilo, ki se najpogosteje uporablja za kontrastiranje vzorcev, je običajno 0,3% metilen modro. Lahko pa se uporabljajo tudi drugi, na primer 0,5% malahitno zelena.

Tehnika

Postopek hitro obarvanja s kislino

Pripravite si bakterijski razmaz

Ta priprava poteka na čistem, suhem diapozitivu, pri čemer upoštevajte varnostne ukrepe.

Sušenje razmaza

Pustite, da se razmaz posuši pri sobni temperaturi.

Vzorec segrejte

Vzorec je treba segreti tako, da spodnji del drsimo ogenj. Fiksacija alkohola je mogoča, kadar razmaza ni bilo pripravljeno s sputumom (obdelanim z natrijevim hipokloritom, da bi ga pobelil) in če ne bo takoj obarval.

M. tuberculosis se odstrani z belilom in med postopkom obarvanja. Toplotna fiksacija neobdelanega sputuma ne bo uničila M. tuberculosis, medtem ko je fiksacija alkohola baktericidna.

Pokrijte madež

Barva je prekrita z raztopino karbolnega fuksina (primarni osnovni madež).

Segrejte madež

To se naredi 5 minut. Opazili bi evolucijo pare (približno 60 ° C). Pomembno je, da se vzorec ne pregreva in se izognete izgorevanju vzorca.

Pri segrevanju madeža je treba biti zelo previden pri segrevanju karbolnega fuksina, še posebej, če se obarvanje izvaja na pladnju ali drugi posodi, v kateri so bili zbrani vnetljivi kemikalije iz prejšnjega obarvanja.

Pod diapozitivi je treba uporabiti le majhen plamen z uporabo predhodno prižganega brisa, navlaženega z nekaj kapljicami kislega alkohola, metanola ali 70% etanola. Izogibajte se uporabi velikega brisa, namočenega v etanolu, saj je to požarna nevarnost.

Operite madež

To pranje je treba opraviti s čisto vodo. Če voda iz pipe ni čista, jo razmažite s filtrirano ali destilirano vodo.

Maza prekrijte s kislim alkoholom

Ta kisli alkohol naj bo 3%. Pokrivanje se izvaja 5 minut ali dokler razmaz ni dovolj razbarvan, to je bledo roza barve.

Upoštevati je treba, da je kisli alkohol vnetljiv; zato ga je treba uporabljati zelo previdno. Izogibajte se bližini vžiga.

Operite madež

Pranje mora biti s čisto destilirano vodo.

Maza pokrijte z madežem

Lahko je malahitno zelena (0,5%) ali metilensko modra (0,3%) obarvanost 1 do 2 minuti, z daljšim časom, če je razmaz tanek.

Operite madež

Spet je treba uporabiti čisto (destilirano) vodo.

Za odtok

Zadnjo stran diapozitiva je treba očistiti in madež postaviti na drenažni stojalo, da se lahko posuši na zraku (za sušenje ne uporabljajte vpojnega papirja).

Preučite bris pod mikroskopom

Uporabiti je treba objektiv 100X in potopno olje. Sistematično skenirajte razmazo in si zapišite ustrezna opažanja.

Razložite rezultate

Teoretično se mikroorganizmi, ki obarvajo rdečkasto barvo, štejejo za hitro kislinsko pozitivne (AAR +).

Nasprotno, če mikroorganizmi obarvajo modro ali zeleno, se glede na barvilo, ki se uporablja kot proti barvilo, štejejo za hitro kislinsko negativno (AAR-).

Reference

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Osnove praktične mikrobiologije (1. izd.). Medicinski založniki bratov Jaypee.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologija z boleznimi po telesnem sistemu (4. izd.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Uvodna mikrobiologija (1. izd.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratorijski priročnik in delovni zvezek iz mikrobiologije: Vloge za nego pacientov (11. izd.). McGraw-Hill izobraževanje.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Učbenik mikrobiologije (1. izd.). Publikacije BI PVT.