BARVA PO GRAMU: UTEMELJITEV, MATERIALI, TEHNIKA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Gram madež je najenostavnejši in najbolj uporaben obarvanje tehnika v diagnostičnem mikrobiologije. To tehniko je leta 1884 ustvaril danski zdravnik Hans Christian Gram, ki mu je uspelo razvrstiti bakterije kot gram-pozitivne in gram-negativne glede na sestavo celične stene.

Hucker je leta 1921 tehniko doživel določene modifikacije za stabilizacijo reagentov in izboljšanje kakovosti obarvanja, zato je madež po Gramu znan tudi kot Gram-Hucker.

Različne razmaze, obarvane z Gramovim madežem. A. Gram pozitivni kaki. B. Gram negativne palice. C. Gram-pozitivne, polimorfonske in mononuklearne bacile. D. Kvas.

S to tehniko je mogoče opazovati tudi obliko mikroorganizmov, torej če so to med njimi kaki, bacili, kokobacili, pleomorfni, nitasti. Kot tudi njegova porazdelitev v prostoru: v grozdu, v verigi, izolirani, v parih, v tetrah itd.

Kadar obstaja sum na bakterijsko okužbo, je treba večino prejetih vzorcev razmazati z diapozitivom in po mikroskopskem pregledu obarvati Gram.

Gramovo poročilo bo zdravnika napotilo, kakšen tip mikroorganizmov je lahko vzrok okužbe, preden dobi končni rezultat kulture.

V nekaterih primerih je življenje pacienta zelo ogroženo, zato zdravniki nujno potrebujejo poročilo Gram, da opravijo empirično zdravljenje, medtem ko čakajo na identifikacijo mikroorganizma.

Če na primer Gram razkrije, da v cerebrospinalni tekočini obstajajo gram-pozitivni koki, bo zdravnik začetno terapijo usmeril z antibiotiki, ki odpravljajo to vrsto bakterij, v skladu s protokoli, ki so zanj določeni.

Ko bo končni rezultat dosegel ime izoliranega mikroorganizma in njegovega ustreznega antibiograma, bo zdravnik presodil, ali naj terapijo spremeni ali ne. Ta odločitev bo sprejeta glede na študijo občutljivosti mikroorganizma za antibiotike, ki jih prejema, in evolucijo pacienta.

Osnove

To je tehnika, ki ima 4 temeljne korake: obarvanje, fiksacija z mordantom, sprememba barve in kontrasta. Zato ta tehnika poleg barvanja bakterij omogoča tudi razlikovanje.

Kristalna vijolica je prvo uporabljeno barvilo. Ima afiniteto do peptidoglikana in bo obarval vse prisotne bakterije vijolično, naknadno se postavi lugol, ki deluje kot mordant, torej bo sprožil tvorbo netopnih kristalno vijolično-jodnih kompleksov - ribonuklearnih beljakovin znotraj celice. .

Gram pozitivne bakterije, ki imajo debelo steno peptidoglikana, tvorijo bolj komplekse (kristalno vijolično-jod), zato obdržijo barvilo.

Poleg tega vpliva tudi, da v steni Gram pozitivnih bakterij vsebuje večjo količino nenasičenih kislin, ki kažejo veliko afiniteto do oksidantov (Lugol).

Medtem imajo Gram negativne bakterije tanko plast peptidoglikana, zaradi česar bakterije tvorijo manj kompleksov kot Gram pozitivne.

Nato sledi korak razbarvanja, kjer se Gram pozitivne in gram negativne bakterije obnašajo drugače.

Gram negativne bakterije vsebujejo zunanjo membrano, bogato z lipopolisaharidi, ki je del njihove celične stene. Maščobe se uničijo s stikom z acetonskim alkoholom, zato se zunanja membrana destabilizira, pri čemer se sprosti vijolični kristal.

Tako se nato upre s safraninom ali osnovnim fuksinom, ki postane rdeč.

V primeru gram-pozitivnih bakterij se upirajo bledi, saj belilo deluje tako, da zapre pore in prepreči, da bi kristalno vijolični / jodni kompleks uhajal ven.

Zato obarvanost s kristalno vijolično ostane stabilna in ni prostora za safranin ali fuksin. Zaradi tega te bakterije obarvajo temno modro ali vijolično.

materiali

Set za obarvanje Grama je sestavljen iz:

• Vijolično steklo
• Lugol
• Aceton alkohol
• Safranin ali osnovni fuksin

Priprava barvil in reagentov

Kristalno vijolična raztopina

Rešitev za:

Vijolični kristal ------------- 2 gr

Etilni alkohol 95% ----------- 20cc

Rešitev B:

Amonijev oksalat ----------- 0,8 gr

Destilirana voda ------------- 80 ccm

Za končno pripravo kristalno vijolične barve moramo raztopino A razredčiti 1:10 z destilirano vodo in pomešati s 4 deli raztopine B. Zmes shranimo 24 ur. S filtrirnim papirjem filtrirajte v stekleničko za barvanje z jantarno barvo.

Znesek, ki ga je treba dnevno uporabiti, se prenese v steklenico z jantarno kapljico.

Iodo-Lugol

Natehtamo in izmerimo navedeno količino vsake spojine na naslednji način:

Jodni kristali ------------- 1gr

Kalijev jodid ------------- 2gr

Destilirana voda ------------- 300 ccm

Kalijev jodid se malo raztopi v vodi in nato dodamo jod. Raztopino stresemo v jantarno steklenico.

Znesek, ki ga je treba dnevno uporabiti, se s kapalko prenese v manjšo jantarno steklenico.

Beljenje

95% etilni alkohol -----------– 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Pripravljen je v enakih delih. Pokrijemo dobro, saj ponavadi izhlapi.

Položite v stekleničko za kapalko.

Ta pripravek zagotavlja razbarvanje v zmernem času 5-10 sekund in je najbolj priporočljiv.

Začetniki raje uporabljajo samo 95% etilni alkohol, pri katerem bledenje poteka počasneje od 10 do 30 sek.

Medtem ko izkušenejši lahko uporabljajo čisti aceton, kjer se od 1 do 5 sek zelo hitro pojavi razbarvanje.

Kontrast

Zaloga Safranin

Safranina -------------– 2,5 gr

Etilni alkohol 95% --------– 100 ccm

Po tehtanju navedene količine safranina ga raztopimo v 100 ml 95% etilnega alkohola.

Delovna raztopina safranina je pripravljena iz osnovne raztopine.

Če želite to narediti, izmerite 10 cm3 osnovne raztopine, dodajte 90 cm3 destilirane vode, da dobite 100 ml.

Priporočljivo je, da količino, ki jo boste porabili vsak dan, prenesite v jantarno steklenico s kapalko.

Mikroorganizmi, ki obarvajo slabo Gram-negativno z Gram-Hucker-jevim madežem, kot so nekateri anaerobi, Legionella sp, Campylobacter sp in Brucella sp, lahko obarvamo s Kopeloffovo modifikacijo madeža po Gramu-Huckerju veliko bolje, imenovan Gram-Kopeloff madež.

Ta tehnika spremeni safraninsko barvilo v osnovni fuksin. S to spremembo je mogoče učinkovito obarvati prej omenjene mikroorganizme.

Shranjevanje z reagenti

Pripravljena barvila je treba hraniti na sobni temperaturi.

Priprava razmaza vzorca, ki ga je treba obarvati

Vzorec mora vsebovati vsaj 10 ⁵ mikroorganizmov, preden je verjetno opaziti mikroorganizem v razmazu. Razmaze je mogoče izdelati iz neposrednega vzorca ali iz kultur v trdnem ali tekočem mediju.

Za boljšo vizualizacijo prisotnih struktur morajo biti razmazi enakomerni, dobro razporejeni in ne preveč gosti.

-Graba neposrednih vzorcev

Gram necefriziranega urina

Urin zmešamo in na drsnik damo 10 µl. Če opazimo vsaj eno bakterijo / potopno polje, kaže, da obstaja okužba.

To pomeni, da bo imela kultura približno 85.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) urina v 85% primerov.

Ta metoda ni uporabna za število kolonij pod 100.000 CFU.

CSF Gram

CSF je treba centrifugirati, supernatant odstraniti in kroglico razpredati na diapozitivu. Ta tekočina je v normalnih pogojih sterilna; opazovanje bakterij kaže na okužbo.

Gram dihalnih vzorcev

Pravilo izpljunka z gramom, bronhijem ali bronhoalveolarjem, čeprav lahko obstajajo različni mikroorganizmi, bo vedno vodilo diagnozo, poleg tega, da bo koristna vrsta opazovanih celic.

V primeru sputuma je treba razmaz pripraviti z najbolj gnojnimi deli vzorca.

Gram blata

Na tej vrsti vzorcev ni priporočljivo izvajati gram, saj nima diagnostične vrednosti.

-Grame pridelkov

Izvedemo jih lahko na dva načina, enega iz tekočih kultur in drugega iz trdnih kultur.

Tekoče kulture

Iz tekočih kultur je izjemno preprosto; Več pečenk motne juhe se vzame pod gorilnik in se postavi na čist in suh drsnik, s krožnimi gibi od središča proti obodu, da se material enakomerno porazdeli.

Na zraku naj se spontano posuši. Ko se posuši, se material pritrdi na pločevino s toploto. Če želite to narediti, se s pomočjo pincete list položi 3 do 4 krat skozi plamen gorilnika Bunsen, pri čemer pazite, da ne gorijo materiala.

Pustite, da se list ohladi, in ga položite na most za barvanje.

Trdni pridelki

Za razmazovanje madežev po Gramu iz čvrste kulture sledimo takole:

Pred izbiro kolonij, ki jih bomo uporabili, je treba pripraviti diapozitiv, v katerega naj se položijo približno dve kapljici sterilne fiziološke raztopine.

Če originalna kulturna plošča vsebuje več različnih vrst kolonij, bo izbrana ločena kolonija vsake za izvajanje Grama. Vsako kolonijo bomo vzeli s platinovo zanko, da se raztopi v fiziološki raztopini, ki je bila predhodno nameščena na diapozitivu.

Krožni premiki se izvedejo od središča proti obodu, da se homogeno porazdeli kolonija na diapozitivu.

Na zraku naj se spontano posuši. Ko se posuši, se list pritrdi s toploto, kot je razloženo prej (s plamenom drsnika z vžigalnikom), pri čemer pazimo, da materiala ne zažgemo.

Ta postopek je treba izvesti z vsako drugo vrsto kolonije. Na listu papirja je treba navesti vrstni red opazovanja, na primer:

Kolonija 1: Beta-hemolitična rumena kolonija: v grozdih so opazili gram-pozitivne koke

Kolonija 2: Kremno obarvana kolonija, brez hemolize: Opaženi so gram-negativni kokobacili.

Vsak diapozitiv mora biti označen, da vemo, kaj opazujemo.

Tehnika

Tehnika obarvanja po Gramu je izjemno enostavna za izvedbo in razmeroma poceni in je ni mogoče zamuditi v mikrobiološkem laboratoriju.

Izvede se na naslednji način:

1. Maza pritrdite s toploto in položite na obarvani most.
2. Drsnik v celoti pokrijte s kristalno vijolično 1 minuto.
3. Izperite z vodo Ne posušite
4. List prekrijte z raztopino lugola, pustite delovati 1 minuto. Izperite z vodo Ne posušite.
5. 5-10 sekund beli z nežnim stresanjem v alkoholni aceton. Ali pa položite list v navpičen položaj in na površino spustite kapljice sredstva za razbarvanje, dokler se ne odstrani presežek neobdelanega vijoličnega stekla. Ne prekoračite.
6. Izperite z vodo Ne posušite.
7. Drsnik na obarvanem mostu zamenjajte in 30 sekund pokrijte s safraninom (Gram-Hucker) ali 1 min z osnovnim fuksinom (Gram-Kopeloff).
8. Umijte z vodo
9. V pokončnem položaju naj se spontano posuši.

Ko se posuši, v svetlobni mikroskop položite 1 kapljico potopitvenega olja, da ga opazujete pod ciljem 100X.

Uporabnost

Ta tehnika omogoča razlikovanje morfotintorialnih razlik večine bakterij.

Kvas se odlikuje tudi po tej obarvanosti. Vzamejo kristalno vijolično, torej obarvajo Gram pozitivno.

Po drugi strani pa lahko ločimo Gram-pozitivne palice, ki tvorijo spore, v katerih je znotraj bacila viden prostor, kjer se je oblikoval endospor, čeprav spore ne obarvajo dobro. Druge tehnike, kot je Shaeffer-Fulton, se uporabljajo za obarvanje spore.

Treba je opozoriti, da se to obarvanje ne uporablja za barvanje vseh vrst bakterij, torej obstajajo primeri, ko obarvanje ne deluje.

V tem primeru lahko omenimo bakterije, ki nimajo celične stene. Na primer: rod Mycoplasma, sferoplasti, ureaplasma, L-oblike in protoplasti.

Zelo slabo obarva tudi bakterije s stenami, bogatimi z mikoličnimi kislinami, kot so mikobakterije, in medceličnimi bakterijami, kot sta klamidija in riketija.

Prav tako je neučinkovit pri obarvanju večine spirohetalnih bakterij.

Obstajajo bakterije istega rodu, ki jih lahko opazimo v istem vzorcu kot gram-pozitiven in gram-negativen. Ko se to zgodi, se imenuje spremenljiv po Gramu madež, ki je lahko posledica spremembe hranil, temperature, pH ali koncentracije elektrolitov.

Pogoste napake

Pretirano beljenje

Pretiravanje na stopnji razbarvanja lahko privede do opažanja lažnih Gram negativnih mikroorganizmov.

Ne čakajte dovolj dolgo časa sušenja, da dodate potopno olje

Lahko povzroči, da gram-pozitivne bakterije obarvajo gram-negativno (lažno gram-negativno). To se zgodi, ker v starih kulturah verjetno obstajajo mrtve ali razvajene bakterije in pod temi pogoji bakterije ne zadržijo kristalno vijolične.

Uporabite zelo staro raztopino lugola:

Sčasoma lugol izgubi lastnosti in barva zbledi. Če uporabimo že degenerirani reagent, ta ne bo dobro pritrdil kristalno vijolične barve, zato obstaja možnost pridobitve vizualizacije lažnih Gram negativnih mikroorganizmov.

Modro ozadje

Pravilno razbarvano ozadje bo rdeče. Modro ozadje kaže, da je bilo obarvanje premalo.

Reference

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medicinska mikrobiologija, 6. izdaja McGraw-Hill, New York, ZDA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Argentina. Uredništvo Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Splošna mikologija. Druga izdaja centralne univerze v Venezueli, izdaje knjižnic. Venezuela Caracas.
5. "Gram madež." Wikipedija, prosta enciklopedija. 4. oktober 2018, 23:40 UTC 9 dec 2018, 17:11. Vzeto s es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Priročnik medicinske mikrobiologije. 2. izdaja, Venezuela: Direktorat za medije in publikacije Univerze v Carabobu.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Osnovni madeži v laboratoriju za mikrobiologijo. Raziskave na področju invalidnosti. 2014; 3 (1): 10–18.