MIKRORAŠČICE DNK: POSTOPEK IN APLIKACIJE - BIOLOGIJA - 2025

DNK Mikromrežni , imenovan tudi DNA čip ali DNK Mikromrežni, je sestavljen iz niza fragmentov DNA, zasidranega na fizično podporo spremenljive materiala, bodisi iz plastike ali stekla. Vsak del DNK predstavlja zaporedje, ki dopolnjuje določen gen.

Glavni cilj mikroračunov je primerjalna študija izražanja nekaterih zanimivih genov. Na primer, običajno je, da se ta tehnika uporablja za dva vzorca - enega v zdravih razmerah in enega patološkega -, da se ugotovi, kateri geni se izražajo in kateri niso v vzorcu s stanjem. Omenjeni vzorec je lahko celica ali tkivo.

Avtor Paphrag z angleške Wikipedije (prenesen iz en.wikipedia v Commons.), Via Wikimedia Commons

Na splošno je mogoče izražanje genov odkriti in količinsko določiti s pomočjo fluorescentnih molekul. Manipuliranje čipov v večini primerov opravi robot, hkrati pa je mogoče analizirati veliko število genov.

Ta nova tehnologija je uporabna za široko paleto disciplin, od medicinske diagnostike do različnih študij molekularne biologije na področju proteomike in genomike.

Iz česa je sestavljeno?

Mikrorasti DNK (deoksiribonukleinska kislina) so niz specifičnih segmentov DNK, pritrjenih na trdno matrico. Te sekvence dopolnjujejo genov, ki želijo, da bi študiral in ne more biti do 10.000 genov na cm ² .

Te značilnosti omogočajo sistematično in množično proučevanje genske ekspresije organizma.

Informacije, ki jih mora celica delovati, so kodirane v enotah, imenovanih "geni". Določeni geni vsebujejo navodila za ustvarjanje esencialnih bioloških molekul, imenovanih proteini.

Gen se izrazi, če se njegova DNK transkribira v vmesno molekulo RNA molekule in izražanje gena se lahko razlikuje glede na stopnjo transkripcije tega segmenta DNK. V določenih primerih lahko sprememba izražanja kaže na bolezni.

Načelo hibridizacije omogoča delovanje mikroračunov. DNK je molekula, sestavljena iz štirih vrst nukleotidov: adenina, timina, gvanina in citozina.

Da bi tvorili dvojno vijačno strukturo, adeninske skupine s timinom in citozin z gvaninom. Tako sta dve komplementarni verigi lahko povezani z vodikovimi vezmi.

Vrste mikroračunov

Glede na strukturo mikroračunov obstajata dve različici: po meri izdelana komplementarna DNK ali oligonukleotidi in komercialna mikroraščišča z visoko gostoto, ki jih izdelujejo komercialna podjetja, na primer Affymetrix GeneChip.

Prva vrsta mikroračunov omogoča analizo RNA iz dveh različnih vzorcev na enem čipu, druga različica pa je komercialnega tipa in ima veliko število genov (na primer Affymetrix GeneChip ima približno 12.000 človeških genov), kar omogoča analizo en sam vzorec.

Proces

Izolacija RNA

Prvi korak pri izvedbi poskusa z uporabo tehnologije mikroarray je izolacija in čiščenje molekul RNA (lahko je messenger RNA ali druge vrste RNA).

Če želite primerjati dva vzorca (zdrav med bolniki, med drugim nadzor nad zdravljenjem), je treba izvesti izolacijo molekule v obeh tkivih.

Izdelava in označevanje cDNA

Nato se RNA podvrže postopku obratne transkripcije v prisotnosti označenih nukleotidov in tako dobimo komplementarno DNA ali cDNA.

Oznaka je lahko fluorescentna in se mora razlikovati med obema tkivima, ki ju je treba analizirati. Na tradicionalen način se uporabljajo fluorescentne spojine Cy3 in Cy5, saj oddajajo fluorescenco na različnih valovnih dolžinah. V primeru Cy3 je barva blizu rdeče barve, Cy5 pa ustreza spektru med oranžno in rumeno.

Hibridizacija

CDNA mešamo in inkubiramo v mikroarri DNA, da omogočimo hibridizacijo (tj., Da pride do vezave) cDNA iz obeh vzorcev z delom DNK, imobiliziranega na trdni površini mikroarke.

Višji odstotek hibridizacije s sondo v mikroarki se interpretira kot višji ekspresija tkiva ustrezne mRNA.

Sistemsko branje

Kvantifikacija izraza se izvede z vključitvijo bralnega sistema, ki dodeli barvno kodo količini fluorescence, ki jo oddaja vsaka cDNA. Če se na primer rdeča uporablja za označevanje patološkega stanja in se hibridizira v večjem deležu, bo prevladovala rdeča komponenta.

S tem sistemom je mogoče poznati prekomerno izražanje ali zatiranje vsakega gena, analiziranega v obeh izbranih pogojih. Z drugimi besedami, transkript vzorcev, ocenjenih v poskusu, je lahko znan.

Larssono, z Wikimedia Commons

Prijave

Trenutno mikroraščice veljajo za zelo močno orodje na medicinskem področju. Ta nova tehnologija omogoča diagnosticiranje bolezni in boljše razumevanje, kako se spreminja izražanje genov v različnih zdravstvenih pogojih.

Poleg tega omogoča primerjavo kontrolnega tkiva in tkiva, ki se zdravi z določenim zdravilom, da se preučijo učinki možnega medicinskega zdravljenja.

Da bi to naredili, primerjamo normalno in bolno stanje pred in po uporabi zdravila. S preučevanjem učinka zdravila na genom in vivo imamo boljši pregled nad njegovim mehanizmom delovanja. Prav tako je mogoče razumeti, zakaj nekatera določena zdravila vodijo do neželenih stranskih učinkov.

Rak

Rak je na vrhu seznamov bolezni, ki so jih preučevali z mikroračuni DNA. Ta metodologija se uporablja za razvrščanje in prognozo bolezni, zlasti v primeru levkemije.

Raziskovalno področje tega stanja vključuje stiskanje in karakterizacijo molekularnih baz rakavih celic, da bi našli vzorce izražanja genov, ki povzročajo neuspehe pri uravnavanju celičnega cikla in v procesih celične smrti (ali apoptoze).

Druge bolezni

Z uporabo mikroračunov je bilo mogoče razjasniti diferencialne ekspresijske profile genov v zdravstvenih pogojih alergij, primarnih imunskih pomanjkljivosti, avtoimunskih bolezni (kot je revmatoidni artritis) in nalezljivih bolezni.

Reference

1. Bednar, M. (2000). Tehnologija in uporaba DNK mikrorašč. Medicinski znanstveni monitor, 6 (4), MT796-MT800.
2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS,… & Gullans, SR (2001). Analiza mikroraščkov DNA zapletenih bioloških procesov. Časopis American Society of Nephrology, 12 (5), 1072-1078.
3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, RJ (2002). Poskusi z mikroraščanjem DNK: biološki in tehnološki vidiki. Biometrija, 58 (4), 701–717.
4. Plous, CV (2007). Mikroraščice DNK in njihove uporabe v biomedicinskih raziskavah. Revija CENIC. Biological Sciences, 38 (2), 132-135.
5. Wiltgen, M., & Tilz, GP (2007). Analiza mikroraščic DNA: načela in klinični vpliv. Hematologija, 12 (4), 271-287.