MEDIJ LÖWENSTEIN-JENSEN: TEMELJ, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Löwenstein-Jensen medij je selektivni trdni medij za izolacijo in razvoj bakterij iz rodu Mycobacterium, kot Mycobacterium tuberculosis, M. avium, med drugim, z izjemo vrste leprae, ki ni culturable.

Bakterije iz rodu Mycobacterium ne rastejo v običajnih kulturah, zato je bilo treba oblikovati poseben medij za njihovo izolacijo. Prvotni medij je ustvaril Löwenstein, kasneje pa ga je modificiral Jensen.

Medij Löwenstein-Jensen s kolonijami Mycobacterium tuberculosis. Vir: Agarwal in drugi / BioMed Central Ltd., z dovoljenjem Knjižnice bioloških slik

Sprememba je vsebovala izločanje rdečega barvila v Kongu, ki ga je nadomestilo z večjo koncentracijo malahitnega zelenega. Prav tako je spremenil koncentracije magnezijevega citrata in monokalijevega fosfata.

Medij Löwenstein-Jensen trenutno vsebuje krompirjev škrob, asparagin, magnezijev citrat, monokalijev fosfat, magnezijev sulfat, malahit zeleno, nalidiksično kislino, cikloheksimid, linkomicin, pretepla jajca, glicerin in vodo.

Mikobakterije so običajno izolirane na mestih, ki niso sterilna, med drugim sputum, urin, absces. To pomeni, da bo večina vzorcev vsebovala običajno mikrobioto območja, poleg patogena.

Zato medij Löwenstein-Jensen v svoji sestavi vsebuje vrsto zaviralcev, ki jih predstavljajo malahit zelena, antibiotiki in protiglivična zdravila.

Poleg tega je treba vzorce, ki prihajajo z nesterilnih mest, dekontaminirati in nevtralizirati, preden jih sejemo v medij Löwenstein-Jensen.

Osnove

Prisotnost jajca in glicerina v mediju Löwenstein-Jensen spodbuja rast mikobakterij, ker zagotavljata maščobne kisline in beljakovine, potrebne za razvoj teh mikroorganizmov.

Medij Löwenstein-Jensen vsebuje malahit zeleno, ki je zaviralec spremljajoče mikrobiote. Vsebuje pa tudi nalidiksično kislino (35 µg / mL), ki zavira Gram negativno mikrobioto, cikloheksimid (400 µg / mL), ki zavira saprofitne glive in kvasovke, ter linkomicin (2 µ / mL), ki zavira Gram pozitivno mikrobioto.

Nekatera komercialna podjetja raje dodajo naslednjo kombinacijo antibiotikov: polimiksin B 200.000 enot / L, amfotericin B 10 mg / L, karbenicilin 50 mg / L in trimetoprim 10 mg / L.

Ta medij ne vsebuje agarja, zato pride do strjevanja medija zaradi koagulacije albumina, ki je prisoten v jajcu med sterilizacijo.

Priprava

V 600 ml destilirane vode, ki ji je bilo predhodno dodanih 12 ml glicerola, se tehta 37,3 g dehidriranega medija. Zmes segrevamo, pogosto mešamo, dokler se popolnoma ne raztopi. Sredstvo samodejno razredčite pri 121 ° C 15 minut.

Po drugi strani je treba v aseptičnih pogojih pripraviti homogeno suspenzijo 1000 ml svežih jajc. Jajčni suspenziji dodajte 600 ml gojišča, pripravljenega pri temperaturi 50 - 60 ° C, da se izognete zračnim mehurčkom.

Antibiotične raztopine dodamo tudi po sterilizaciji v avtoklavu.

Medij nalijte v sterilne epruvete z vijaki. Epruvete segrejte pri 85 ° C 45 minut v nagnjenem položaju.

Barva pripravljenega gojišča je akvamarinsko zelena in zaradi prisotnosti jajčnih lipidov lahko pojavijo belkaste lise.

PH medija mora biti 7,2 ± 0,2

Epruvete shranjujte v hladilniku in zaščitene pred neposredno svetlobo do uporabe. Kaljenje pred setvijo.

Medij se imenuje "Gruft modifikacija Löwensteina Jensena". Ta vsebuje enake spojine kot klasični medij, vendar je dodan RNA-5mg / 100 ml, kot inhibitorji pa vsebuje malahitno zeleno 0,025 g / 100 ml, penicilin 50 U / ml in nalidiksično kislino 35 ug / ml.

Prijave

Medij Löwenstein-Jensen se uporablja za izolacijo mikobakterij iz različnih vrst vzorcev. Za vse vzorce, pri katerih obstaja sum na prisotnost mikobakterij, priporočamo madež Ziehl-Neelsen.

Nekateri vzorci prihajajo s sterilnih mest, drugi pa ne. Nesterilni vzorci morajo biti po potrebi razkuženi:

Sputum

Vzorce sputuma je treba razkužiti na naslednji način: določite količino vzorca sputuma v ml in dodajte enako količino 4% NaOH v vzorec in inkubirajte pri 37 ° C.

Mešanico pogosto pretresite v 30 minutah. Nato 30 minut centrifugirajte pri 3000 RPM.

Supernatant zavrzite nad fenolno razkužilo raztopino. Usedlino uporabite za setev, vendar je treba najprej pH nevtralizirati.

Za nevtralizacijo usedlin uporabimo 5% H ₂ SO ₄ v prisotnosti indikatorja fenolnega rdečega, dokler ne doseže nevtralnega pH, ki povzroči barvo lososa.

Izpiranje želodca, izpiranje bronhijev in bronhialni aspirat

V tem primeru je treba vzorec 30 minut centrifugirati pri 3000 RPM. Supernatant se zavrže in peleti se uporabijo. Za razkuževanje usedline dodajte 3 ml 4% NaOH in pogosto mešajte pri 37 ° C pol ure.

Znova centrifugiramo, supernatant zavržemo in uporabimo pelet. Slednje je treba nevtralizirati, kot je razloženo v vzorcu sputuma.

Urin

Pustite, da se vzorec strdi v hladilniku 24 ur. Ločeno supernatant ločite. Preostalo pelet je treba centrifugirati 30 minut pri 3000 RMP. Ponovno zavržemo supernatant in pelet ponovno pripravimo s 3 ml sterilne fiziološke raztopine.

Dodamo 3 ml 4% NaOH in nadaljujemo z dekontaminacijo in nevtralizacijo, kot je opisano prej.

Ascites tekočina, plevralna tekočina, cerebrospinalna tekočina

V tej vrsti vzorca se centrifugira in supernatant se zavrže. Izvedite gram na usedlini ali opazujte neposredno pod mikroskopom; Če bakterij ne opazimo, stopnja dekontaminacije ni potrebna, prav tako pa tudi korak nevtralizacije.

V tem primeru se lahko vzorec sadi neposredno z usedlino. Če obstajajo bakterije, nadaljujte z dekontaminacijo in nevtralizacijo, kot je opisano zgoraj.

Biopsije

Temu vzorcu je treba dodati 5 ml destilirane vode, da se kasneje centrifugira pri 1500 RPM 10 minut. Zavrzite supernatant in ponovno centrifugirajte pelet pri 3500 RPM 30 minut. Uporabite usedlino za setev gojišča.

Larinalni bris

Bris treba postaviti v sterilno cev, ki vsebuje enake dele destilirane vode in 4% NaOH. Bris treba pritisniti ob stene cevi, tako da se vzorec razredči v tekočini. Centrifugirajte in uporabite usedlino. Nevtralizirajte usedline, kot je že opisano.

Posejano

Medij Löwenstein-Jensen inokuliramo z dodajanjem 0,5 ml vzorca na površino medija. Zavrtite epruveto, da vzorec porazdelite po mediju. Ne uporabljajte platinastega ročaja.

Za izolacijo Mycobacterium bovis in drugih vrst, ki ne rastejo na gojišču Löwenstein-Jensen, se lahko seme drugo cev, ki vsebuje Stonebrink medij.

Inkubacija

Cepive, ki jih nataknemo, inkubiramo aerobno pri 37 ° C, pokrovček je rahlo ohlapen in nagnjen pri približno 5 ° ter zaščiten pred svetlobo. Okolje je mogoče obogatiti s 5–10% ogljikovega dioksida. Dvakrat na teden preverjajte kulture, dokler se ne pojavijo kolonije.

Ko je vzorec absorbiran, se kapice zategnejo. Najdaljši čas inkubacije je 8 tednov, če po tem času ni rasti, se poroča kot negativno.

QA

Za kontrolo kakovosti se lahko uporabljajo naslednji sevi:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogec 320 320 Atccoc, 320 ATC, 320 ATC, 320 ATC, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC 27, 34

Pri prvih treh omenjenih vrstah je pričakovati odličen razvoj, rast M. fortuitum bi morala biti dobra, medtem ko pri M. bovis ne pričakujemo majhne rasti. Medtem je treba vrste, ki niso rod Mycobacterium, v celoti zavirati.

Omejitve

Pripravljen medij mora biti zaščiten pred svetlobo, dolgotrajna izpostavljenost svetlobi povzroči, da se medij spremeni iz zelene v modro, v tem primeru tega medija ni več mogoče uporabiti. To je zato, ker je malahitno zelena fotosenzibilna.

Medij, ki vsebuje jajca, se lahko zlahka kontaminira, če z njim ne ravnamo aseptično. Lahko se raztopi, če postane onesnažen s proteolitičnimi bakterijami.

Gojenje in ravnanje z bakterijami iz rodu Mycobacterium zahteva usposobljeno osebje, ki pozna ukrepe za biološko varnost, ki jih je treba upoštevati, da se ne okužijo ali okužijo drugih.

HCl se v fazi nevtralizacije ne sme uporabljati zaradi tvorbe natrijevega klorida, ki je lahko toksičen za Kochov bacilo.

Vzorce je treba hraniti in zaščititi pred svetlobo, medtem ko jih ne obdelamo.

Referenca

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Selektivni medij Löwenstein-Jensen. Dostopno na: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medij. Dostopno na: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Medij Löwenstein-Jensen. Dostopno na: foodsafety.neogen.com.
4. "Medij Löwenstein-Jensen." Wikipedija, prosta enciklopedija. 20. november 2018, 15:15 UTC 24. april 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testi za identifikacijo bakterij kliničnega pomena. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires Argentina.