CITOGENETIKA: ZGODOVINA, KAJ ŠTUDIRA, TEHNIKE, APLIKACIJE - BIOLOGIJA - 2025

Citogenetski je študija morfologije, strukture in funkcije kromosomov, vključno z njihovimi sprememb v delitvi somatskih celic, ali deliti, in med delitvijo reproduktivne celice ali mejoze.

Citologija proučuje tudi dejavnike, ki povzročajo kromosomske spremembe, vključno s patološkimi, ki se pojavljajo iz generacije v generacijo, in evolucijskimi, ki delujejo na več generacij.

Vir: pixabay.com

Zgodovina

Spominska leta in dogodki v zgodovini citogenetike so naslednji:

- Leta 1842 je Karl Wilhelm von Nägeli opazoval "prehodne matične celice", kasneje imenovane kromosomi.

- Leta 1875 je Eduard Strasburger v rastlinah identificiral kromosome. Leta 1979 je to storil Walther Flemming pri živalih. Flemming je skoval izraze kromatin, profaza, metafaza, anafaza in telofaza.

- Leta 1888 je W. Waldeyer skoval izraz kromosom.

- Leta 1893 je Oscar Hertwig objavil prvo besedilo o citogenetiki.

- Leta 1902 sta Theodor Boveri in Walter Sutton odkrila homologne kromosome.

- Leta 1905 je Nettie Stevens identificirala kromosom Y.

- Leta 1937 sta Albert Blakeslee in AG Avery zaustavila metafazo s kolhicinom, kar je olajšalo opazovanje kromosomov.

- Leta 1968 so Torbjörn Caspersson in drugi opisali skupine Q. Leta 1971 sta Bernard Dutrillaux in Jerome Lejeune opisala skupine R.

- Leta 1971 so o C pasovih razpravljali na konferenci o nomenklaturi človeške kromosome.

- Leta 1975 sta C. Goodpasture in SE Bloom opisala obarvanje z Ag-NOR.

- Leta 1979 je Jorge Yunis opisal metode visoke ločljivosti za skupine G.

- V letih 1986–1988 sta Daniel Pinkel in Joe Gray razvila tehniko FISH (fluorescentna in situ hibridizacija).

- 1989. Hermann - Josef Lüdecke mikrosistemirani kromosomi.

- Leta 1996 sta Evelyn Schröck in Thomas Ried opisala večkromatsko spektralno kariotipsko tipkanje.

Odkritja pri ljudeh

Leta 1914 je Theodor Boveri predlagal, da bi do raka lahko prišlo zaradi kromosomskih sprememb. Leta 1958 je Charles E. Ford med levkemijo opazoval kromosomske nepravilnosti.

Leta 1922 je Theophilus Painter objavil, da ima človek 48 kromosomov. Do leta 1956 sta Jo Hin Tjio in Albert Levan ugotovila, da imata dejansko 46 kromosomov.

Leta 1932 je PJ Waardenburg predlagal, ne da bi dokazoval, da je Downov sindrom lahko posledica kromosomske aberacije. Jerome Lejeune je leta 1959 pri bolnikih z Downovim sindromom dokazal prisotnost dodatnega somatskega kromosoma.

Charles E. Ford je leta 1959 poročal, da ženskam s Turnerjevim sindromom primanjkuje enega od obeh X kromosomov, medtem ko sta Patricia Jacobs in John Strong odkrila prisotnost dodatnega X kromosoma pri moških s Klinefelterjevim sindromom.

Leta 1960 sta JA Böök in Berta Santesson opisala triploidijo, Klaus Patau je opisal trisomijo 13, John Edwards pa trisomijo 18.

Leta 1969 je Herbert Lubs prvi odkril sindrom Fragile X. Istega leta so amniocentezo začeli uporabljati za citogenetsko diagnozo.

Področje študija

Citogenetiki preučujejo kromosomsko evolucijo živih bitij in uporabljajo kariotipe za filogenetsko analizo in reševanje taksonomskih težav.

Poleg tega raziskujejo epidemiološke vidike človeških kromosomskih aberacij in okoljskih dejavnikov, ki jih povzročajo, diagnosticirajo in zdravijo bolnike, ki jih prizadenejo kromosomske nepravilnosti, in razvijajo molekularne pristope za razvozanje strukture, delovanja in evolucije kromosomov.

Morfologija kromosomov

Vsak kromosom je sestavljen iz dveh kromatid, ki ju povezuje zožitev, imenovana centromera. Odseke kromosoma, ki se začnejo iz centromerja, imenujemo roke.

Kromosomi se imenujejo metacentrični, kadar imajo sredino v sredini; submetacentrične, če imajo rahlo stran od sredine, tako da nasprotni kraki niso enake dolžine; akrocentričen, če je centromera blizu ene od skrajnosti; in telocentrično, če je centromera le na enem koncu kromosoma.

Tehnike: obdelava vzorcev

Korak za obdelavo vzorcev je naslednji.

Pridobitev vzorca

Pridobitev potrebnega tkiva, shranjevanje v mediju in v primernih vialah.

Kultura

Razen vzorcev za analizo RIB je pred spravanjem pridelka potrebno obdobje med enim dnevom in več tedni.

Nabirano

Gre za pridobivanje celic v metafazi.

Ustavitev mitoze

Standardna citogenetska analiza zahteva zaustavitev mitoze, tako da celice ostanejo v metafazi z uporabo kolhicina ali Colcemid®.

Hipotonično zdravljenje

Poveča volumen celic, kar omogoča, da se kromosomi razširijo.

Pritrditev

3: 1 metanol-ocetna kislina se uporablja za odstranjevanje vode iz celic, utrjevanje membran in kromatina za obarvanje.

Priprava listov

Fiksne celice se razprostirajo na diapozitivih mikroskopa, nakar se posušijo.

Obarvanje s kromosomom

Obstaja več načinov obarvanja, s katerimi lahko prepoznamo razlike med kromosomi. Najpogostejši je G.

Mikroskopska analiza

Omogoča izbiro primernih celic za opazovanje in fotografiranje kromosomov.

Priprava kariogramov

Na podlagi fotografij celic v metafazi so sestavljene slike niza kromosomov reprezentativne celice za kasnejšo študijo.

Kromosomski pasovi

Obstajajo štiri vrste kromosomskih pasov: heterokromatski pasovi; evromatski pasovi, regije, ki organizirajo nukleol (NORs); kinetohore.

Heterokromatski pasovi se pojavljajo kot diskretni bloki. Ustrezajo heterokromatinu, ki vsebuje zelo ponavljajoče sekvence DNA, ki predstavljajo običajne gene in se na vmesniku ne dekondenzirajo.

Eukromatski pasovi so sestavljeni iz niza izmeničnih segmentov, na katere obarvanje ali nanje ne vpliva. Ti pasovi se razlikujejo po velikosti in tvorijo značilne vzorce, značilne za vsak par kromosomov vrste, zaradi česar so zelo koristni za identifikacijo kromosomskih premestitev in preureditev.

NOR so tisti segmenti kromosomov, ki vsebujejo na stotine ali tisoče genov ribosomske RNA. Običajno jih predstavljamo kot zožitve.

Kinetohore so vezna mesta vretena mikrotubule na kromosome.

Barvanje kromosomskega pasu

Hromosomski pas sestoji iz tehnik obarvanja, ki razkrivajo vzorce vzdolžne diferenciacije (svetla in temna področja), ki jih ni bilo mogoče videti drugače. Ti vzorci omogočajo primerjavo različnih vrst in preučevanje evolucijskih in patoloških sprememb na ravni kromosomov.

Metode vezanja s kromosomom so razdeljene na tiste, ki uporabljajo absorpcijsko obarvanje, navadno Giemsa pigmente, in tiste, ki uporabljajo fluorescenco. Metode za absorpcijsko obarvanje zahtevajo predhodno fizikalno-kemijsko obdelavo, kot je opisano v "Predelava vzorcev".

Nekatere vrste pasov omogočajo dokaze o vzorcih kromosomov z omejenimi območji, povezanih s funkcionalnimi lastnostmi. Druge omogočajo vizualizacijo razlik med homolognimi kromosomi, ki omogočajo identifikacijo segmentov.

C pasovi

C-pas obarva večino heterokromatičnih pasov, zaradi česar je univerzalna tehnika prikaza prisotnosti heterokromatina v kromosomih. Druge metode obarvajo le del celotnega heterokromatina, zaradi česar so boljše od C-vezave za razlikovanje med vrstami heterokromatina.

Q pasovi

Q-vezanje je najstarejša tehnika obarvanja. Svoje ime dolguje uporabi kvinrinara. Učinkovit je ne glede na način priprave kromosomov. Je alternativna metoda za vezanje G. Uporablja se le redko, vendar je njegova zanesljivost koristna, če je material majhen ali ga je težko vezati.

G pasov

Danes se najbolj uporablja G-pas, ki temelji na uporabi Giemsa in tripsina. Omogoča zaznavanje premestitev, inverzij, izbrisov in podvajanj. To je najbolj uporabljena metoda za karakterizacijo kariotipov pri vretenčarjih, ki prikazuje razlike med kromosomi, ki jih ni mogoče razlikovati samo na podlagi njihove morfologije.

R pasovi

R trak ustvari vzorec obarvanega obarvanja glede na pas G (svetli R pasovi so enaki temnim G pasom in obratno). R trak je še posebej uporaben za poudarjanje koncev kromosomov, ki se ob uporabi G pasu rahlo obarvajo.

T pasovi

T-pas je različica pasu R, v katerem ni obarvanja večine intersticijskih pasov kromosomov, tako da so končna območja kromosomov intenzivno obarvana.

Ag-NOR pasovi

Ag-NOR trak se uporablja za iskanje NOR z obarvanjem srebra. Pri povezovanju z Ag-NOR neaktivni geni NOR ne bodo obarvani. Zato se ta pas uporablja za preučevanje sprememb aktivnosti ribosomalnih genov med gametogenezo in embrionalnim razvojem.

Fluorescentna hibridizacija in situ (FISH)

FISH vezanje omogoča vizualizacijo kromosomov z uporabo fluorescentno označenih sond. Tehnologija FISH omogoča kariotipsko analizo celic, ki se ne delijo.

FISH vezanje omogoča odkrivanje specifičnih zaporedij DNK v kromosomih, celicah in tkivih. Zato ga lahko uporabimo za odkrivanje kromosomskih nepravilnosti, ki vključujejo majhne segmente DNK.

FISH vezanje je utrlo pot dvema bolj sofisticiranima povezanima tehnikama, poznanima kot spektralno kariotipizacija (SKY) in večbarvna FISH (M-FISH).

V SKY in M-FISH se uporabljajo fluorescentna barvila, ki skupaj proizvajajo kombinacije barv, po eno za vsak kromosom. Te tehnike so bile zelo uporabne pri odkrivanju zapletenih kromosomskih aberacij, kot so bile opažene pri določenih tumorjih in pri akutni limfoblastični levkemiji.

Medicinske aplikacije

- Citogenetika raka. Pri tumorjih so pogoste kromosomske aberacije in aneuploidije. Kromosomske translokacije imajo lahko kancerogene učinke s proizvodnjo fuzijskih beljakovin. Citogenetika se uporablja za spremljanje napredka zdravljenja raka.

- Krhka mesta in zlom kromosomov. Krhka mesta kromosomov lahko privedejo do patologij, kot je sindrom Fragile X. Izpostavljenost citotoksičnim učinkovinam lahko povzroči zlom kromosomov. Nosilci nekaterih avtosomskih mutacij nimajo možnosti popravljanja DNK, poškodovanih med zlomom kromosoma.

- Numerične nepravilnosti kromosomov. Število kromosomov lahko diagnosticira trisomijo, kot je tista, ki povzroči sindrome Downa, Edwarda in Pataua. Omogoča tudi diagnozo Turnerjevega in Klinefelterjevega sindroma.

- Pri kronični mielogenski levkemiji imajo bele krvne celice "Philadelphia kromosom". Ta nenormalni kromosom je rezultat translokacije kromosomov 9 in 22.

Reference

1. Abbott, JK, Nordén, AK, Hansson, B. 2017. Evolucija spolnih kromosomov: zgodovinski uvidi in perspektive prihodnosti. Zbornik kraljevega društva B, 284, 20162806.
2. Cregan, ERC 2008. Vse o mitozi in mejozi. Založništvo ustvarjalcev materialov, Huntington Beach, CA.
3. Gersen, SL, Keagle, MB, eds. 2013. Načela klinične citogenetike. Springer, New York.
4. Gosden, JR, ed. 1994. Metode v molekularni biologiji, letnik 29. Protokoli za analizo kromosomskih analiz. Humana Press, Totowa, NJ
5. Hughes, JF, Page, DC 2015. Biologija in evolucija kromosomov Y sesalcev. Letni pregled genetike, 49, 22.1–22.21.
6. Kannan, TP, Alwi, ZB 2009. Citogenetika: preteklost, sedanjost in prihodnost. Malaysian Journal of Medical Sciences, 16, 4–9.
7. Lawce, HJ, Brown, MG 2017. Citogenetika: pregled. V: Priročnik za laboratorij za citogenetiko AGT, četrta izdaja. Arsham, MS, Barch, MJ, Lawce, HJ, eds. Wiley, New York.
8. Sacerdot, C., Louis, A., Bon, C., Berthelot, C., Crollius, HR 2018. Evolucija kromosomov ob nastanku genoma prednikov vretenčarjev. Genome Biology, 19, 166.
9. Schubert, I. 2007. Evolucija kromosomov. Trenutno mnenje iz biološke rastline, 10, 109-115.
10. Schulz-Schaeffer, J. 1980. Citogenetika - rastline, živali, ljudje. Springer-Verlag, New York.