OBARVANJE GIEMSA: UTEMELJITEV, MATERIALI, TEHNIKA IN UPORABE - BIOLOGIJA - 2025

Giemsu je vrsta barvanje kliničnih vzorcev, glede na zmes kislih in bazičnih barvil. Njeno ustvarjanje je navdihnilo delo Romanowskega, kjer je Gustav Giemsa, kemik in bakteriolog, ki izvira iz Nemčije, izpopolnil z dodajanjem glicerola za stabilizacijo spojin.

Spremembe, ki so nastale v izvirni tehniki Romanowskega, so omogočile bistveno izboljšanje mikroskopskih opazovanj, zato so tehniko krstili z imenom madeža Giemsa.

Različni vzorci, obarvani z madežem Giemsa. A. Trypanosoma evansi v periferni krvi. B. Normalne krvne celice. C. Borrelia theileri v periferni krvi. D. Burkittov limfom.

Ker gre za preprosto tehniko izvedbe, visoko funkcionalno in ekonomično, se trenutno v kliničnem laboratoriju pogosto uporablja za hematološke razmaze, vzorce kostnega mozga in odseke tkiv.

Tehnika obarvanja Giemsa je zelo koristna za citološke študije, saj omogoča opazovanje specifičnih celičnih struktur. Ta tehnika obarva citoplazme, jedra, nukleole, vakuole in granule celic, s čimer lahko ločimo celo drobne sledi kromatina.

Poleg tega je mogoče zaznati pomembne spremembe v velikosti, obliki ali obarvanosti jedra, kjer je mogoče vizualizirati izgubo odnosa jedro-citoplazma.

Po drugi strani pa omogoča prepoznavanje nezrelih celic v kostnem mozgu in periferni krvi, kar je pomembno za diagnozo resnih bolezni, kot je levkemija. Med drugim je mogoče odkriti tudi hemoparazite, zunajcelične in medcelične bakterije, glive.

V citogenetiki se pogosto uporablja, saj je možno preučiti mitozo celic.

Osnove obarvanja Giemsa

Barve tipa Romanowsky temeljijo na uporabi kontrasta med kislimi in bazičnimi barvili, da se doseže obarvanje osnovne in kisle strukture. Kot je razvidno, obstaja afiniteta kislih barvil, ki obarvajo osnovne strukture in obratno.

Osnovno uporabljeno barvilo je metilen modro in njegovi oksidirani derivati ​​(Azure A in Azure B), kislo barvilo pa eozin.

Kisle strukture celic so med drugim nukleinske kisline, zrnca segmentiranih bazofilov, zato bodo obarvane z metilen modro.

V tem istem smislu so osnovne strukture celic hemoglobin in nekatere zrnce, kot so tiste, ki jih vsebujejo segmentirani eozinofili, med drugim; te bodo obarvane z eozinom.

Po drugi strani pa lahko zaradi dejstva, da so metilensko modri in azurni značilni, da so mehkromatska barvila, različnim strukturam različen odtenek glede na obremenitev polianiatov, ki jih imajo.

Tako strateška kombinacija bazičnih in kislih barvil uspe razviti širok spekter barv, glede na biokemične značilnosti vsake strukture, ki se sprejemajo skozi bledo modre, temno modre, lila in vijolične odtenke v primeru kislih struktur.

Medtem ko je obarvanje eozina bolj stabilno, ustvarja barve med rdečkasto oranžno in lososom.

materiali

Materiali za pripravo osnovne raztopine

Za pripravo osnovne raztopine je potrebno tehtati 600 mg praška Giemsa madež, izmeriti 500 ml metilnega alkohola brez acetona in 50 ml nevtralnega glicerina.

Kako pripraviti osnovno raztopino

Težek prašek Giemsa položite v malto. Če obstajajo grudice, jih je treba razpršiti. Nato dodajte pomembno količino izmerjenega glicerina in zelo dobro premešajte. Dobljeno zmes vlijemo v zelo čisto jantarno steklenico.

Preostali del glicerina damo v malto. Ponovno premešajte, da očistite preostalo barvilo, ki se je prilepilo na stene malte in prelijte v isti kozarec.

Stekleničko zapremo in postavimo v vodno kopel pri 55 ° C za 2 uri. Medtem ko je v vodni kopeli, mešanico nežno pretresite vsakih pol ure.

Nato zmes pustimo, da se ohladi, da se alkohol postavi. Pred tem del odmerjenega alkohola damo v malto, da zaključimo pranje preostalega barvila, nato pa ga dodamo mešanici skupaj s preostalim alkoholom.

Ta pripravek je treba pustiti, da dozori vsaj 2 tedna. Uporabljeni del osnovne raztopine je treba filtrirati.

Da se izognete onesnaženju pripravka, priporočamo, da del, ki bo v stalni uporabi, prenesete v majhno jantarno steklenico s kapalko. Napolnite vsakič, ko reagenta zmanjka.

Materiali za pripravo raztopine puferja

Po drugi strani pripravimo pufersko raztopino pri pH 7,2 na naslednji način:

6,77 g natrijevega fosfata (brezvodnega) (NaHPO ₄ ), 2,59 g kalijevega dihidrogenfosfata (KH ₂ PO ₄ ) in destilirane vode se tehta do 1000 ccm.

Končna priprava barvila

Za pripravo končne raztopine za obarvanje izmerimo 2 ml filtrirane osnovne raztopine in pomešamo s 6 ml puferne raztopine. Mešajte mešanico.

Pomembno dejstvo, ki ga je treba upoštevati, je, da se tehnike priprave barvil lahko spreminjajo, odvisno od komercialne družbe.

Dodatni materiali, potrebni za izvedbo barvanja

Poleg opisanih materialov morate imeti moške za barvanje, majice z vodo ali blažilnikom za pranje, predmetne diapozitive ali prevleke za predmete, štoparico za nadzor nad časom barvanja in blot za papir ali nekaj materiala, ki se lahko uporablja za sušenje ( gaza ali bombaž).

Tehnika

Postopek obarvanja

1) Pred obarvanjem mora biti raztopina vzorca pripravljena na čistem diapozitivu.

Vzorci so lahko kri, kostni mozeg, histološki odseki tkiv ali cerviko-vaginalni vzorci. Priporočljivo je, da so namazi tanki in imajo 1 do 2 uri sušenja pred barvanjem.

2) Na most za barvanje položite vse liste, ki jih je treba obarvati. Vedno delate v istem vrstnem redu in vsak list je dobro prepoznan.

3) Na razmazo položite nekaj kapljic 100% metilnega alkohola (metanola) in pustite, da deluje 3 do 5 minut, da se vzorec pritrdi in dehidrira.

4) Zaprite metanol, ki je prisoten na listu, in pustite, da se posuši na zraku.

5) Ko se posuši, končno raztopino za obarvanje položite s kapalko, dokler ni pokrit celoten list. Pustite delovati 15 minut. Nekateri avtorji priporočajo do 25 min. Odvisno je od poslovne hiše.

6) madež izcedite in razmažite z destilirano vodo ali s 7,2 pufersko raztopino.

7) Na blotting papirju pustite, da se listi posušijo na prostem, razporejeni navpično s pomočjo opore.

8) Očistite zadnjo stran diapozitiva z alkoholnim tamponom ali vatirano palčko, da odstranite morebitne sledi madežev.

Javne službe

Tehnika obarvanja Giemsa se uporablja na različnih področjih, med njimi: hematologiji, mikologiji, bakteriologiji, parazitologiji, citologiji in citogenetiki.

Hematologija

Je ta madež najpogostejša uporaba. Z njim je mogoče identificirati vsako celico, ki je prisotna v vzorcih kostnega mozga ali periferne krvi. Poleg tega, da ocenimo število posameznih serij, lahko odkrijemo levkocitozo ali levkopenijo, trombocitopenijo itd.

Ker je občutljiv pri prepoznavanju nezrelih celic, je pomemben pri diagnozi akutnih ali kroničnih levkemij. Med drugim je mogoče postaviti tudi diagnozo anemije, kot so anemija srpastih celic, srpasta celica.

Mikologija

Na tem področju je njegova uporaba običajna za iskanje histoplazme capsulatum (znotrajcelične dimorfne glive) v vzorcih tkiva.

Bakteriologija

V hematoloških brisih, obarvanih z zdravilom Giemsa, je mogoče zaznati Borrelias sp pri bolnikih, ki imajo bolezen, imenovano ponavljajoča se vročina. Sprorote je veliko med eritrociti v vzorcih, odvzetih na vrhuncu vročine.

V okuženih celicah je mogoče tudi vizualizirati medcelične bakterije, kot sta Rickettsia sp in Chlamydia trachomatis.

parazitologija

Na področju parazitologije je obarvanje z zdravilom Giemsa omogočilo diagnozo parazitskih bolezni, kot so malarija, Chagasova bolezen in lajšmanijoza.

V prvih dveh parazitih Plasmodium sp in Trypanosoma cruzi lahko opazimo v periferni krvi okuženih bolnikov, najdemo jih v različnih stopnjah, odvisno od stopnje bolezni.

Za izboljšanje iskanja parazitov v krvi je priporočljivo uporabiti madež Giemsa, pomešan z madežem May-Grünwald.

Prav tako lahko kožno leishmanijo diagnosticiramo z oceno vzorcev biopsije kože, obarvanih z Giemso, kjer odkrijemo zajedavca.

Citologija

Obarvanje z giemso se uporablja tudi za citološko preučevanje endocervikalnih vzorcev, čeprav v ta namen ni najpogosteje uporabljena tehnika.

V pomanjkanju virov pa ga je mogoče uporabiti, če ima podobno funkcionalnost kot tiska, ki jo ponuja tehnika Papanicolaou, in z nižjimi stroški. Vendar pa za to potrebuje strokovno znanje izpraševalca.

Citogenetika

Pomembna značilnost obarvanja Giemsa je njegova sposobnost, da se močno veže na adeninske in timijanske regije bogate DNA. To omogoča vizualizacijo DNK med mitozo celic v različnih kondenzacijskih stanjih.

Te študije so potrebne za odkrivanje kromatskih aberacij, kot so podvajanja, brisanja ali premestitve različnih regij kromosomov.

Raziskave, ki dokazujejo učinkovitost madeža Giemsa

Cannova in sod. (2016) so primerjali 3 tehnike obarvanja za diagnozo kožne lejšmanije.

Za to so uporabili vzorce, pridobljene od poskusne živali (Mesocrisetus auratus), poskusno inokulirane z Leishmanii.

Avtorja sta dokazala, da je madež Giemsa boljši od madeža Pap-mart® in Gaffney. Zato so menili, da je madež Giemsa idealen za diagnosticiranje kožne lejšmanije.

Odlični rezultati, ki so jih dobili avtorji, so posledica dejstva, da kombinacija barvil, ki sestavljajo mešanico Giemsa, predstavlja potrebne pogoje za ustvarjanje ugodnega kontrasta, ki omogoča jasno razlikovanje struktur amastigotov, tako znotraj kot zunajcelično.

Tudi druge tehnike (Pap-mart® in Gaffney) so to storile, vendar na šibkejši način in zato težje vizualizirajo. Zato se madež Giemsa priporoča za parazitološko diagnozo leishmaniasis.

Prav tako je raziskava Ramírez in sod. (1994) ocenila veljavnost madežev Giemsa in Lendrum v konjunktivnih razmazih za identifikacijo Chlamydia trachomatis.

Avtorji so ugotovili, da imajo madeži Giemsa in Ledrum enake značilnosti, vendar je bilo Giemsa bolj občutljivo.

To pojasnjuje, zakaj se madež Giemsa trenutno najpogosteje uporablja za diagnozo klamidijskih okužb, še posebej, če je malo virov.

Vir: PanReac Applicationhem ITW Reagents. Madež Giemsa. Različica 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španija.

Priporočila za dobro obarvanje

Sušenja rjuh ne bi smeli pospeševati. Za sušenje na prostem je treba pričakovati primeren čas. Približno 2 uri.

Barva takoj po 2 urah za najboljše rezultate.

Da se razmazi bolje pritrdijo in obarvajo, je treba vzorec razporediti na drsnik tako, da ostane tanek in enakomeren sloj.

Prednostni vzorec krvi je kapilarni, saj se razmaz naredi neposredno iz kapljice krvi, zato vzorec ne vsebuje nobenih dodatkov, kar naj bi pripomoglo k vzdrževanju celičnih struktur.

Če pa uporabimo vensko kri, je treba EDTA uporabiti kot antikoagulant in ne heparin, saj heparin običajno deformira celice.

Pogoste napake pri obarvanju Giemsa

V praksi tega barvanja lahko pride do napak. Dokazujejo jih nenadne spremembe v tonalitetah struktur.

Izredno modro barvanje

Do tega lahko pride zaradi:

• Zelo debeli razmazi
• Preseganje časa obarvanja
• Pralno premalo.
• Uporaba reagentov precej nad nevtralnim (alkalnim) pH.

V teh pogojih so barve naslednjih struktur izkrivljene, in sicer tako, da bodo eritrociti namesto da obarvajo losos-roza postali zeleni, zrnca eozinofilcev, ki jih je treba obarvati opečno rdeče, postane modrikasto ali siva in tako naprej odstopanje v običajnih tonih.

Prekomerno rožnato barvanje

Do tega lahko pride zaradi:

• Premalo časa obarvanja.
• Dolgotrajno ali prekomerno pranje.
• Slabo sušenje.
• Uporaba visoko kislih reagentov.

V tem primeru strukture, ki običajno obarvajo modro, ne bodo skoraj vidne, medtem ko bodo strukture, ki obarvajo roza, močno pretirane odtenke.

Primer: Rdeče krvne celice bodo postale svetlo rdeče ali svetlo oranžne, jedrski kromatin se bo pojavil bledo roza, granule eozinofila pa bodo obarvale globoko svetlo rdečo.

Prisotnost oborin v razmazu

Vzroki so lahko:

• Uporabite umazane ali slabo oprane filme.
• Ne dovolite, da se razmaz dobro posuši.
• Raztopino za pritrditev pustimo predolgo.
• Neustrezno pranje na koncu obarvanja.
• Neustrezna filtracija ali brez filtracije uporabljenega barvila.

Prisotnost morfoloških artefaktov

Morfološki artefakti se lahko pojavijo v razmazih, kar otežuje vizualizacijo in interpretacijo prisotnih struktur. To je posledica:

• Vrsta uporabljenega antikoagulanta, kot je heparin.
• Uporaba umazanih, pokvarjenih ali mastnih folij.

Način shranjevanja

Po pripravi je treba barvanje hraniti pri sobni temperaturi (15 - 25 ° C), da se barvilo ne obori. Shranjevati ga je treba v tesno zaprti posodi z jantarjem.

Reference

1. Cannova D, Brito E in Simons M. Vrednotenje tehnik obarvanja za diagnozo kožne leishmaniasis. Salus. 2016; 20 (2): 24–29.
2. PanReac Applicationhem ITW reagenti. Madež Giemsa. Različica 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španija.
3. Clark G. Postopki obarvanja (1981), 4thed. Williams in Willkins.
4. Uporabna klinična kemija. Madež Giemsa za in vitro diagnostiko. Distributer: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F in Grazioso C. Veljavnost madežev Giemsa in Lendrum v konjunktivnih razmazih za identifikacijo Chlamydia trachomatis. Bol iz Sanit Panama. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Splošna mikologija. 1994. Druga izdaja osrednje univerze v Venezueli, izdaje knjižnic. Venezuela Caracas.
7. "Madež Giemsa." Wikipedija, prosta enciklopedija. 1. september 2017, 01:02 UTC 6. dec 2018, es.wikipedia.org.