IMUNOFLUORESCENCA: UTEMELJITEV, PROTOKOL IN APLIKACIJE - BIOLOGIJA - 2026

Imunofluorescenca je močna tehnika imuno uporabo protiteles, kovalentno vezan na fluorescentne molekule, da prepoznajo specifične cilje v vzorcih celičnih osnovnih na trden nosilec.

Ta tehnika vključuje mikroskopsko opazovanje z imunološko specifičnostjo, kar omogoča opazovanje živih ali mrtvih celic, ki lahko predstavljajo majhne količine antigenov. Široko se uporablja tako na področju raziskav kot v klinični diagnozi različnih patologij.

Imunološko označevanje aktinskih filamentov v celicah kardiomiocitov (Vir: Ps1415 prek Wikimedia Commons)

Ta tehnika, predvsem kvalitativna (z nekaterimi količinskimi različicami), se nanaša zlasti na vizualizacijo vzorca s signalom produkta fluoroforja, ki je fluorescentna molekula, vezana na protitelo in ki lahko vzbuja na določeni valovni dolžini. .

V celičnem kontekstu je zelo koristno preučiti prisotnost / odsotnost in podcelično lokacijo proteinov. Tehnika se je sprva uporabljala v kliničnem okolju za diagnozo virusov, kot je gripa, nato pa še za številne druge nalezljive bolezni.

Je zelo občutljiva tehnika in z ustrezno opremo za mikroskopijo ima lahko zelo dobro ločljivost. Za opazovanje potrebuje uporabo mikroskopov konfokalnih ali epifluorescentnih.

Kljub temu, da je zelo priljubljen, pa lahko predstavlja nekaj pomembnih težav v zvezi s pridobivanjem nespecifične fluorescence, ki ustvarja nekaj "hrupa" v ozadju, kar pogosto omejuje ustrezno branje rezultatov.

Osnove

Imunofluorescenca temelji na izkoriščanju biološkega pojava reakcije medsebojnega delovanja protitelesa in antigena. To se nanaša posebej na vizualizacijo ali odkrivanje te reakcije z vznemirljivimi fluorescenčnimi molekulami do določene valovne dolžine.

Protitelo je protein imunoglobulina, ki se izloča iz aktivnih B celic, ki je posebej ustvarjen proti antigenu, na katerega se lahko veže z visoko afiniteto in specifičnostjo. Imunofluorescenca uporablja IgG imunoglobuline, ki so topni v krvnem serumu.

Protitelesa so molekule do 950 kDa, sestavljene iz dveh kratkih (lahkih) in dveh dolgih "težkih" peptidnih verig "Y". Tako lahka kot težka veriga sta razdeljena na dve domeni: ena spremenljivka, ki lahko prepozna antigen, druga pa konstantna ali ohranjena, značilna za vsako vrsto.

Antigeni so funkcionalno opredeljeni kot molekule, ki jih lahko protitelo prepoznamo in so večinoma beljakovine. Ko je žival izpostavljena antigenu, se aktivirajo limfociti imunskega sistema, ki proizvajajo specifična protitelesa proti njej in delujejo kot obrambni sistem.

Antigen, kot je na primer protein, ima lahko več kot en epitop ali mesto prepoznavanja s protitelesom, zato ima lahko serum živali, ki je izpostavljen antigenu, poliklonalna protitelesa proti različnim regijam istega proteina.

Imunofluorescenca torej izkorišča sposobnost živali, da proizvede poliklonalna protitelesa proti specifičnemu antigenu, da bi ga očistila in nato uporabila za odkrivanje istega antigena v drugih okoliščinah.

Med fluorescentna barvila ali molekule, ki se najpogosteje uporabljajo za nekatere imunofluorescenčne tehnike, sodijo fluorescein izotiocianat (FITC), tetrametilrodamin izotiocianat-5 in 6 (TRITC), številni cianini, kot so Cy2, Cy3, Cy5 in Cy7, in barvila, imenovana Alexa Fluor® , na primer Alexa Fluor®448.

Protokol

Imunofluorescenčni protokol se razlikuje glede na številne dejavnike, vendar na splošno vključuje linearno zaporedje korakov, sestavljeno iz:

• Priprava plošč in celic
• Fiksacija vzorcev
• Permeabilizacija
• Blokiranje
• Imuno obarvanje ali imunološko obarvanje
• Sestavljanje in opazovanje

-Priprava

Od vzorcev

Priprava vzorcev bo odvisna od njihove narave in vrste izkušenj, ki jih je treba izvesti. Najpreprostejši primer, ki vključuje uporabo celic v suspenziji, bo pojasnjen spodaj.

Celice v suspenziji, torej v tekočem gojišču, je treba najprej ločiti od nje s centrifugiranjem, nato pa jih sprati z pufersko raztopino ali izosmotskim "pufrom", ki ohranja njihovo celovitost.

Običajno uporabimo fosfatno-fiziološki pufer, znan kot PBS, v katerem celice resuspendiramo in to zmes ponovno centrifugiramo, da dobimo celice brez gojišča, ki lahko vsebujejo moteče snovi.

Od rezil

Tudi diapozitivi, ki se uporabljajo za mikroskopsko opazovanje, kjer bodo celice pozneje pritrjene na ustrezne postopke za nadaljnjo obdelavo, morajo biti tudi skrbno pripravljeni.

Ti so prekriti ali "senzibilizirani" z raztopino poli-lizina, sintetičnega polimera, ki bo deloval kot "molekularno lepilo" med celicami in trdno oporo, zahvaljujoč elektrostatični interakciji med pozitivnimi naboji njihovih amino skupin in celicami. negativni naboji proteinov, ki prevlečejo celice.

Fiksacija vzorcev

Ta postopek je sestavljen iz imobilizacije beljakovin, ki jih najdemo v celici, da bi ohranili nedotaknjeno njihovo prostorsko lokacijo. Uporabljene molekule morajo biti sposobne križati vse vrste celičnih membran in tvoriti rešetke s kovalentnimi proteini.

Široko se uporabljajo formalmaldehid in paraformaldehid, glutaraldehid in celo metanol, s katerimi se celični vzorci določen čas inkubirajo in nato sperejo z izosmotsko raztopino pufra.

Po pritrditvi celic se še naprej pritrdijo na liste, predhodno senzibilizirane s poli-lizinom.

Permeabilizacija

Glede na vrsto preskusa, ki se opravi, bo potrebno preučiti celice, ki jih preučujemo, ali ne. Če želimo vedeti lokacijo, prisotnost ali odsotnost določenega proteina na površini celice, permeabilizacija ne bo potrebna.

Če želite vedeti, kakšna je lokacija beljakovin v celici, je permeabilizacija bistvenega pomena in bo sestavljena iz inkubacije vzorcev s Tritonom X-100, detergentom, ki lahko prepušča celične membrane.

Blokiranje

Temeljni korak vseh imunoloških tehnik je blokiranje. Na tej stopnji postopka je blokiranje sestavljeno iz prekrivanja na senzibiliziranih listih vseh mest z molekuli poli-lizina, na katere se celice niso lepile. Se pravi, preprečuje vsako nespecifično zvezo.

Običajno se za blokiranje uporabljajo raztopine z govejim serumskim albuminom (BSA) v pufru PBS, najboljši rezultati pa so daljši, ko je s to raztopino daljši čas inkubacije. Po vsakem koraku, vključno z blokiranjem, je potrebno sprati preostalo raztopino.

Imuno obarvanje ali imunološko obarvanje

Postopek imuno obarvanja ali imunološko obarvanje bo odvisen predvsem od tega, ali gre za neposredno ali posredno imunofluorescenco (glejte spodaj).

Če gre za primarno ali neposredno imunofluorescenco, se vzorci inkubirajo z želenimi protitelesi, ki morajo biti povezana s fluorescentnimi barvili. Postopek inkubacije je sestavljen iz redčenja protiteles v raztopini, ki bo vsebovala tudi BSA, vendar v nižjem deležu.

Če gre za sekundarno ali indirektno imunofluorescenco, je treba izvesti dve zaporedni inkubaciji. Najprej z želenimi protitelesi in nato s protitelesi, ki lahko zaznajo konstantna področja primarnih imunoglobulinov. Prav ta sekundarna protitelesa so kovalentno vezana na fluorofore.

Tehnika je zelo vsestranska in omogoča istočasno označevanje več kot enega antigena na vzorec, če obstajajo primarna protitelesa, povezana z različnimi fluoroforji, v primeru neposredne imunofluorescencije.

Za sočasno označevanje pri indirektni imunofluorescenci je treba zagotoviti, da se vsako primarno protitelo proizvede pri drugi živali, in da je vsako sekundarno protitelo povezano z različnim fluoroforjem.

Tako kot blokiranje daje tudi inkubacija s protitelesi boljše rezultate. Po vsakem koraku je potrebno izprati odvečna protitelesa, ki se niso vezala na vzorce, pri sekundarni imunofluorescenci pa je potrebno blokirati, preden dodamo sekundarno protitelo.

Nekatere tehnike uporabljajo druge madeže, ki niso povezani z imunološko obarvanjem, na primer obarvanje jedrske DNK s fluoroforjem DAPI.

Sestavljanje in opazovanje

Med zadnjim časom inkubacije s fluoroforji je treba, da vzorci ostanejo v temi. Za opazovanje pod mikroskopom je običajno, da nekatere snovi uporabimo za ohranitev fluorescence fluorofor, skupaj s protitelesi.

Vrste

Grafični povzetek neposredne in posredne imunofluorescence (Vir: Westhayl618 prek Wikimedia Commons)

Neposredna ali primarna imunofluorescenca

To je povezano z odkrivanjem antigenov z uporabo fluorescentnih protiteles. Glavna prednost uporabe te tehnike je njegova hitrost, vendar se lahko v postopku pojavijo številni primeri nespecifične vezave, zlasti pri preučevanju človeških serumov, saj so bogata z visoko heterogenimi protitelesi.

Posredna ali sekundarna imunofluorescenca

Znana je tudi kot "sendvič" tehnika, kar vključuje razvoj tehnike v dveh korakih. Prvo se nanaša na uporabo nefluorescentnega protitelesa in njegovo vezavo na zanimiv antigen.

Proti konstantnemu območju tega prvega protitelesa (ki bo zdaj služil kot antigen) se uporabi drugo protitelo, ki ga je sposobno prepoznati, ki je povezano s fluorescentno molekulo.

Pojav fluorescentnega signala bo rezultat specifičnega prepoznavanja med prvim nefluorescentnim protitelesom in zanimivim antigenom; prisotnost tega prvega protitelesa pogojuje tisto z drugim, ki je označeno in s pomočjo katerega je mogoče določiti prisotnost ali odsotnost antigena.

Kljub temu, da je mnogo bolj zamudna tehnika kot neposredna imunofluorescenca (saj vključuje še en korak inkubacije), ta tehnika ne vključuje oblikovanja fluorescentnega protitelesa za vsak preučeni antigen, kar v ekonomskem smislu pomeni, bolj sposobni za preživetje.

Poleg tega gre za bolj občutljivo tehniko v smislu ojačanja signala, saj se več kot eno sekundarno protitelo lahko veže na konstantno območje primarnega protitelesa in tako poveča intenzivnost fluorescentnega signala.

Prijave

Kot smo že omenili, je imunofluorescenca izredno vsestranska tehnika, ki se je na številne načine uporabljala na znanstvenem in kliničnem področju. Uporablja se lahko za odgovor na ekološka, ​​genetska in fiziološka vprašanja v zvezi z mnogimi organizmi.

Med kliničnimi aplikacijami se uporablja za neposredno diagnozo nekaterih dermatoloških bolezni, bodisi z uporabo neposredne bodisi posredno imunofluorescenco na epitelijskem tkivu preiskovanih bolnikov.

Imunofluorescenčne tehnike so bile na voljo pri enoceličnih organizmih, kot je kvas, za vizualizacijo znotrajjedrnih in citoplazemskih mikrotubul, aktina in z njimi povezanih beljakovin, 10 nm filamentov in drugih sestavin citoplazme, membrane in celične stene.

Reference

1. Abcam, imunocitokemija in imunofluorescenčni protokol. Pridobljeno z abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescentna barvila. Pridobljeno iz leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Imunofluorescenčna mikroskopija. V metodah celične biologije (letnik 48, str. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID in Cook, D. (2013). Imunofluorescenčne tehnike. Časopis za raziskovalno dermatologijo, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Imunofluorescenčne metode za kvas. V metodah encimologije (Vol. 194, str. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Uporaba imunofluorescence v javnozdravstveni virologiji. Bakteriološki pregledi, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG in Anderson, DM (1996). Imunofluorescenca v raziskavah fitoplanktona: aplikacije in potencial. J: Phycol. , 32, 1–16.