DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENILINDOL): ZNAČILNOSTI, UTEMELJITEV, UPORABA - KEMIJA - 2025

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) je barvilo s fluorescentno premoženja služi kot je marker, ki se pogosto uporabljajo v stroki za fluorescenčno mikroskopijo ali med drugim pretočno citometrijo. Fluorescenca, ki jo oddaja, je svetlo modre barve, njeno vzbujanje se pojavi med 455-461 nm (UV svetloba).

Barvilo DAPI lahko z veliko lahkoto prehaja skozi celično membrano mrtvih celic. Lahko obarva tudi jedra živih celic, toda v tem primeru mora biti koncentracija tega višja.

Kemična zgradba fluorescentnega barvila DAPI. Vir: Slika: Datoteka: DAPI.svg je vektorska različica te datoteke. Uporabiti bi ga morali namesto te rastrske slike, če ni manjvreden / Richard Wheeler (Zephyris) Urejena slika

Barvilo lahko dostopa do celične DNK, za katero ima posebno afiniteto in se z veliko avidnostjo veže na dušikove baze adenin in timin. Zaradi tega je v nekaterih tehnikah molekularne biologije zelo uporaben.

Ta spojina spada v skupino indolnih barvil in dokazano je, da ima večjo občutljivost na DNK kot etidijev bromid in propidijev jodid, zlasti na agaroznih gelih.

Uporaba tega fluorescentnega barvila je zelo široka, saj je uporabna za: preučevanje sprememb DNK v apoptotičnih procesih (celična smrt) in zato zaznavanje celic v tem procesu; za odtis fotografij na DNK (tiskanje fotografij na DNA); preučiti bakterijsko kontaminacijo; ali za vizualizacijo jedrske segmentacije.

Uporabljali so ga tudi pri preučevanju kromosomskih pasov, pri odkrivanju Mycoplasmas sp DNA, pri interakciji DNA-protein, pri obarvanju in štetju celic z imunofluorescenco in celo za barvanje zrelih cvetnih prahu.

značilnosti

DAPI je kratica njegovega kemijskega imena (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Njegova molekularna formula je C ₁₆ H ₁₅ N _5. Ima molekulsko maso 350,3. V bližini območja UV svetlobe (345 do 358 nm) pride do največjega vzbujanja kompleksa DAPI-DNA, medtem ko največja emisija fluorescence pride med 455-461 nm.

Za to barvilo je značilen rumen prah, vendar strukture, označene s tem fluoroforom, oddajajo sijočo modro svetlobo.

Je topiva v vodi, vendar pa se lahko pospeši raztapljanje. Lahko ga razredčimo s PBS, vendar v njem ne raztopimo neposredno.

Ko je barvilo pripravljeno, ga je treba hraniti v temi, torej zaščiteno pred svetlobo, pri temperaturi od 2 do 8 ° C (hladilnik). V teh pogojih je barvilo stabilno več kot 3 tedne ali mesece.

Če je zaščiten pred svetlobo, vendar ga pustimo pri sobni temperaturi, njegova stabilnost pade na 2 ali 3 tedne, vendar je izpostavljena neposredni svetlobi, je poslabšanje zelo hitro. Če želite hraniti veliko dlje, ga lahko hladite pri -20 ° C, razdeljene v alikvotih.

Osnove

To obarvanje temelji na ustvarjanju jedrskega kontrastana v glavnih tehnikah molekularne biologije, kot so: protočna citometrija, fluorescentna mikroskopija in barvanje metafaznih kromosomov ali medfaznih jeder.

Ta tehnika temelji na veliki afiniteti, ki jo ima barvilo za dušikove baze (adenin in timin), ki jih vsebuje genska snov (DNK) v manjšem žlebu. Na citoplazemski ravni pušča zelo malo ozadja.

Ko se fluorescentno barvilo veže na adeninsko in timinsko območje DNA, se fluorescenca znatno poveča (20-krat več). Barva, ki jo oddaja, je svetlo modra. Zlasti ni fluorescenčne emisije pri vezavi na GC (gvanin-citozin) bazne pare.

Pomembno je opozoriti, da čeprav ima tudi afiniteto do RNK, to ne povzroča težav, saj se najvišja stopnja emisije energije iz te molekule pojavi na drugi valovni dolžini (500 nm), za razliko od DNK, ki to počne pri 460 nm. Poleg tega je porast fluorescence, ki je enkrat vezana na RNA, le 20%.

DAPI se bolj uporablja za obarvanje mrtvih (fiksnih) celic kot živih celic, saj je za obarvanje slednjih potrebna veliko večja koncentracija barvila, to pa zato, ker je celična membrana veliko manj prepustna za DAPI, ko je živa.

Barvo DAPI lahko uporabljate v kombinaciji z rdečimi in zelenimi fluoroforji za večbarvno izkušnjo.

Uporaba

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) je odličen fluorofor in se zato široko uporablja v različnih tehnikah in v različne namene. V nadaljevanju je pojasnjena uporaba DAPI v glavnih tehnikah.

Pretočna citometrija

Raziskovalci Gohde, Schumann in Zante leta 1978 so bili prvi, ki so uporabili in predlagali DAPI kot fluorofor v tehniki protočne citometrije, ki so imeli velik uspeh zaradi visoke občutljivosti na DNK in visoke intenzivnosti pri fluorescenčni emisiji.

Uporaba DAPI v tej tehniki omogoča proučevanje celičnega cikla, količinsko določanje celic ter obarvanje živih in mrtvih celic.

Čeprav obstajajo druga barvila, na primer etidijev bromid, Hoechst-ov oksid, akridin pomaranča in propidijev jodid, je DAPI eden izmed najbolj razširjenih, saj je bolj fotostabilen od prej omenjenih.

Za to tehniko je potrebno pritrditi celice, saj lahko uporabimo ta absolutni etanol ali 4% paraformaldehid. Vzorec centrifugiramo in supernatant zavržemo, nato celice hidriramo z dodajanjem 5 ml PBS pufra 15 minut.

Medtem ko mine čas, pripravite DAPI madež s pufrom za obarvanje (FOXP3 od BioLegend) v koncentraciji 3 uM.

Vzorec centrifugiramo, zavržemo supernatant in nato pokrijemo z 1 ml raztopine DAPI 15 minut pri sobni temperaturi.

Vzorec odnesite na pretočni citometer z ustreznim laserjem.

Pretočna mikrofluorometrija

Druga tehnika, pri kateri se uporablja DAPI, je pretočna mikro fluorometrija skupaj z drugim fluoroforjem, imenovanim mitramicin. Obe sta uporabni za posamezno količinsko določitev DNK kloroplasta, vendar je DAPI najbolj primeren za merjenje delcev bakterije T4 bakteriofaga.

Hibridizacija

Ta tehnika v osnovi uporablja DNK sonde, označene s fluorescentnim barvilom, ki je lahko DAPI.

Vzorec zahteva toplotno obdelavo za denaturiranje dvoverižne DNK in pretvorbo v dva enkrana. Nato se hibridizira z denaturirano DNA sondo, označeno z DAPI, ki ima zanimivo zaporedje.

Kasneje ga operemo, da odstranimo tisto, kar ni bilo hibridizirano, za vizualizacijo DNK se uporablja kontrast. Fluorescenčni mikroskop omogoča opazovanje hibridizirane sonde.

Namen te tehnike je odkrivanje specifičnih sekvenc v kromosomski DNK, ki lahko postavijo diagnozo nekaterih bolezni.

Te cito-molekularne tehnike so bile v veliko pomoč pri določanju podrobnosti pri preučevanju kariotipov. Na primer, pokazal je območja adenozina in timina, bogata z baznimi pari, imenovana heterokromatska področja ali pasovi DAPI.

Ta tehnika se pogosto uporablja za preučevanje kromosomov in kromatina pri rastlinah in živalih, pa tudi pri diagnozi prenatalnih in hematoloških patologij pri ljudeh.

Pri tej tehniki je priporočena koncentracija DAPI 150 ng / ml v času 15 minut.

Sestavljene diapozitive je treba hraniti zaščiteno pred svetlobo pri 2-8 ° C.

Imunofluorescentno obarvanje

Celice pritrdimo s 4% paraformaldehidom. Če želimo uporabiti druge madeže, DAPI pustimo na koncu kot protitar, celice pa 15 minut obložimo z raztopino PBS. Medtem ko mine čas, pripravite raztopino DAPI z redčenjem s PBS, tako da končna koncentracija znaša 300 µM.

Nato odvečni PBS odstranimo in pokrijemo z DAPI 5 minut. Večkrat opere. Drsnik si ogledamo pod fluorescentnim mikroskopom pod ustreznim filtrom.

Varnostni list

S to spojino je treba ravnati previdno, saj gre za spojino, ki ima mutagene lastnosti. Za odstranitev te spojine iz vodnih raztopin, ki jih je treba zavreči, se uporablja aktivirano oglje.

Za preprečevanje nesreč s tem reagentom je treba uporabiti rokavice, obleko in zaščitna očala. Če pride do stika s kožo ali sluznico, je treba območje sprati z dovolj vode.

Tega reagenta nikoli ne smete pipetirati skozi usta, uporabljajte pipete.

Ne kontaminirajte reagenta z mikrobnimi sredstvi, ker bo to povzročilo napačne rezultate.

Ne redčite madeža DAPI več kot je priporočeno, saj boste s tem znatno zmanjšali kakovost madeža.

Ne izpostavljajte reagenta neposredni svetlobi in ne bodite topli, ker s tem zmanjšate fluorescenco.

Reference

1. Brammer S, Toniazzo C in Poersch L. Corantes, ki so pogosto vključeni v citogenetiko rastlin. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Dostopno od: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Dostopno na: menarinidiagnostics.com/
3. Citocelični laboratoriji. 2019. Navodila za uporabo DAPI. na voljo na spletnem mestu cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Pojmi in tehnike v rečni ekologiji. (2009). Uredništvo Rubes, Španija. Na voljo na: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Uporaba fluorescence v modificirani disekcijski metodi za oceno števila miocitov v srčnem tkivu. Arhiv Bras. Kardiol. 2012; 98 (3): 252–258. Na voljo pri: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Prisotnost fitoplazme pri papaji (Carica papaya) v Mehiki. Revija Chapingo. Serija o vrtnarstvu, 2011; 17 (1), 47–50. Dostopno na: scielo.org.