HISTOKEMIJA: UTEMELJITEV, PREDELAVA, OBARVANJE - BIOLOGIJA - 2026

Histokemične je koristno orodje pri proučevanju morfologije različnih bioloških tkiv (rastline in živali) zaradi reakcijske načelu komponent tkiva, kot so ogljikovi hidrati, lipidi in proteini, med drugim, kemičnih barvil.

To dragoceno orodje omogoča ne le prepoznati sestavo in strukturo tkiv in celic, temveč tudi različne reakcije, ki se pojavljajo v njih. Prav tako je mogoče dokazati možno poškodbo tkiva, ki jo povzroči prisotnost mikroorganizmov ali drugih patologij.

Histokemični madeži. Nil virus, grampozitivne in gram negativne bakterije (Gram), histoplazma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Vir: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

Histokemija iz preteklih stoletij je prispevala pomembne prispevke, na primer prikaz obstoja krvno-možganske pregrade Paula Ehrlicha. To je bilo mogoče, ker možgani eksperimentalne živali, ki jih je uporabljal Ehrlich, niso bili obarvani z anilinom, ki je osnovno barvilo.

To je povzročilo uporabo različnih barvil, kot sta metilen modri in indofenol, da bi obarvali različne vrste celic. Ta ugotovitev je privedla do razvrstitve celic v acidofilne, bazofilne in nevtrofilne, glede na njihovo specifično obarvanje.

Nedavne študije uporabljajo to tehniko, da bi pokazale prisotnost različnih spojin, vključno s fenoli, pa tudi ogljikovimi hidrati in nestrukturnimi lipidi v tkivih vrste Litsea glaucescens, bolj znane kot lovor. Najdemo te, tako v listju kot v lesu.

Prav tako so Colares in sod., 2016, s histokemičnimi tehnikami identificirali rastlino, ki je zanimiva za zdravilo Tarenaya hassleriana. Pri tej vrsti je bila dokazana prisotnost škroba, mirosina ter fenolnih in lipofilnih spojin.

Osnove

Histokemija temelji na obarvanju celičnih struktur ali molekul, prisotnih v tkivih, zahvaljujoč njihovi afiniteti s specifičnimi barvili. Reakcija obarvanja teh struktur ali molekul v izvirnem formatu se pozneje prikaže v optičnem mikroskopu ali elektronskem mikroskopu.

Specifičnost obarvanja je posledica prisotnosti ionskih sprejemljivih skupin v celicah ali tkivnih molekulah.

Končno je cilj histokemičnih reakcij, da se lahko pokažejo z obarvanjem. Od največjih bioloških struktur do najmanjših tkiv in celic. To lahko dosežemo z dejstvom, da barvila kemično reagirajo z molekulami tkiv, celic ali organelov.

Tožilstvo

Histokemična reakcija lahko vključuje korake pred izvedbo tehnike, kot so fiksacija, vdelava in rezanje tkiva. Zato je treba upoštevati, da se v teh korakih lahko identificira struktura, ki jo je treba identificirati, kar daje lažne negativne rezultate, tudi če je prisotna.

Kljub temu je pomembna predhodna fiksacija tkiva, ki se pravilno izvaja, saj preprečuje avtolizo ali uničenje celic. Za to se med drugim uporabljajo kemične reakcije z organskimi topili, kot so: formaldehid ali glutaraldehid.

Tkanina je vključena tako, da ohrani čvrstost pri rezanju in tako prepreči, da bi se deformirala. Na koncu je rez narejen z mikrotomom za preučevanje vzorcev z optično mikroskopijo.

Pred nadaljevanjem histokemičnega barvanja je priporočljivo, da se v vsako serijo preskusov vključijo zunanje ali notranje pozitivne kontrole. Kot tudi uporaba posebnih barvil za strukture, ki jih je treba preučiti.

Histokemični madeži

Od nastanka histokemijskih tehnik do danes je bil uporabljen širok spekter madežev, tudi tisti, ki se najpogosteje uporabljajo, kot so: Periodna kislina Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen in Gram.

Tudi druga barvila se med drugim uporabljajo manj pogosto, na primer indijsko črnilo, orcein ali Masson-jev trihromski madež.

Šif iz periodične kisline (PAS)

S to obarvanostjo lahko opazimo molekule z visoko vsebnostjo ogljikovih hidratov, na primer: glikogen in mucin. Vendar je koristen tudi za identifikacijo mikroorganizmov, kot so glive in paraziti. Poleg določenih struktur (kletne membrane) v koži in drugih tkivih.

Osnova tega obarvanja je, da barvilo oksidira ogljikove vezi med dvema sosednjima hidroksilnima skupinama. Tako nastane sproščanje aldehidne skupine in to zazna Schiffov reagent, ki oddaja vijolično barvo.

Schiffov reagent je sestavljen iz osnovnega fuksina, natrijevega metabisulfita in klorovodikove kisline, pri čemer so te komponente odgovorne za obarvanje škrlatne barve, kadar so prisotne aldehidne skupine. V nasprotnem primeru nastane brezbarvna kislina.

Intenzivnost obarvanja je odvisna od količine hidroksilnih skupin, prisotnih v monosaharidih. Na primer, pri glivicah, kletnih membranah, mucinih in glikogenu lahko barva preide iz rdeče v vijolično, jedra pa obarvajo modro.

Grocott

Je eden od madežev z največjo občutljivostjo pri identifikaciji gliv v tkivih, zajetih v parafine. To omogoča identifikacijo različnih glivičnih struktur: hife, spore, endospore med drugim. Zato velja za rutinski madež za diagnozo mikoze.

Zlasti se uporablja pri diagnozi pljučnih mikoz, kot so pnevmocistoza in aspergiloza, ki jih povzročajo nekatere glive iz rodov Pneumocystis in Aspergillus.

Ta raztopina vsebuje srebrov nitrat in kromovo kislino, pri čemer je slednja fiksirno sredstvo in barvilo. Osnova je, da ta kislina povzroči oksidacijo hidroksilnih skupin v aldehide s pomočjo mukopolyaharidov, prisotnih v glivičnih strukturah, na primer v celični steni gliv.

Na koncu srebro, ki je prisotno v raztopini, oksidira z aldehidi, kar povzroči črno obarvanje, ki mu rečemo reakcija argentafina. Uporabljajo se lahko tudi kontrastna barvila, kot je svetlo zelena, in tako bodo glivične strukture opažene v črni barvi s svetlo zelenim ozadjem.

Ziehl-Neelsen

To obarvanje temelji na prisotnosti kislinsko-alkoholne odpornosti, delno ali v celoti, v nekaterih mikroorganizmih, kot so rodovi Nocardia, Legionella in Mycobacterium.

Uporaba tega madeža je priporočljiva, saj celična stena prej omenjenih mikroorganizmov vsebuje zapletene lipide, ki ovirajo prodiranje barvil. Še posebej v vzorcih iz dihal.

V njej se uporabljajo močna barvila, kot je karbolni fuksin (osnovno barvilo) in se uporablja toplota, da lahko mikroorganizem zadrži barvilo in se ne razbarva s kislinami in alkoholi. Končno se nanese raztopina metilen modre barve za barvanje struktur, ki so se obarvale.

Pri strukturah, obarvanih rdeče, opazimo prisotnost kislinsko-alkoholne odpornosti, medtem ko so strukture, ki se ne upirajo bledi, obarvane modro.

Gram in kitajsko črnilo

Gram je med drugim zelo koristen madež pri diagnozi bakterijskih in glivičnih okužb. To obarvanje omogoča razlikovanje med grampozitivnimi in gram negativnimi mikroorganizmi, kar jasno kaže razlike, ki obstajajo v sestavi celične stene.

Medtem ko je črnilo iz Indije madež, ki se uporablja za kontrast struktur, ki vsebujejo polisaharide (kapsulo). To je zato, ker se v okolju tvori obroč, ki je možen pri Cryptococcus neoformans.

Orcein

S tem obarvanjem se obarvajo elastična vlakna in kromosomi različnih celic, kar omogoča oceno procesa zorenja slednjih. Zaradi tega je bila zelo koristna pri citogenetskih raziskavah.

To temelji na zaužitju barvila z negativnim nabojem molekul, kot je DNK, ki je prisotna v jedrih najrazličnejših celic. Torej so te obarvane modro do temno vijolično.

Massonov trihrom

Ta madež se uporablja za identifikacijo nekaterih mikroorganizmov ali materialov, ki vsebujejo melaninske pigmente. To je primer mikoz, ki jih povzročajo gnojne glive, feohifomikoza in evimecetom črnega zrna.

Končne misli

V zadnjih letih je bilo veliko napredka pri ustvarjanju novih diagnostičnih tehnik, pri katerih je vključena histokemija, vendar povezana z drugimi temelji ali načeli. Te tehnike imajo drugačen namen, kot v primeru imunohistokemije ali encimohistokemije.

Reference

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. An Chem. 2012; 108 (2): 114–118. Dostopno na: are.iqm.csic.es
2. Mestanza R. Pogostost histokemičnih madežev PAS, Grocott in Ziehl-Neelsen, ki se uporabljajo za identifikacijo mikroorganizmov, opravljena v službi za patološko anatomijo specialne bolnišnice Eugenio Espejo leta 2015 .. Centralna univerza Ekvadorja, Quito; 2016. Dostopno na naslovu: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F. Histokemija, skupna vsebnost fenola in antioksidativno delovanje listov in lesa litsea glaucescens Kunth (Lauraceae). Les in gozdovi. 2014; 20 (3): 125-137. Dostopno na: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Anatomija in histokemija Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), vrste zdravilnega interesa. Latinskoameriški in karibski bilten Zdravilnih in aromatičnih rastlin 2016; 15 (3): 182–191. Dostopno na: redalyc.org
5. Bonifaz A. Osnovna medicinska mikologija. 4. izdaja. Mehika: McGraw-Hill Interamericana editores, SA de CV 2012.
6. Silva Diego Filipe Bezerra, Santos Hellen Bandeira de Pontes, León Jorge Esquiche, Gomes Daliana Queiroga de Castro, Alves Pollianna Muniz, Nonaka Cassiano Francisco Weege. Klinično patološka in imunohistokemijska analiza vretenoceličnega ploščatoceličnega karcinoma jezika: redek primer. Einstein (São Paulo) 2019; 17 (1): eRC4610. Dostopno od: scielo.br