FOSFATNI PUFER (PBS): UTEMELJITEV, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2025

Fosfatni pufer, fosfatni pufer s soljo ali SBT je pufer izotonična, katerih funkcija je , da vzdržujemo pH in osmotski tlak čim bližje naravno biološko okolje (fiziološke). Akronim PBS pomeni fosfatno fiziološko raztopino.

PH in osmolarnost sta dva zelo pomembna vidika, ki ju je treba nadzorovati v določenih laboratorijskih protokolih. V primeru pH je nujno, da je nadzorovan, zlasti pri biokemijskih reakcijah, saj se lahko razlikujejo ali ne izvajajo, če so reaktanti pri neprimernem pH.

Fiziološka raztopina s PBS fosfatom pri dveh različnih pH. Vir: Pixinio.com

Medtem je nadzor osmolarnosti bistvenega pomena zlasti pri delu z živimi celicami, saj plazemske membrane celic reagirajo glede na koncentracijo topljenih snovi, v katerih so.

Če celice prenesemo v hipertonični medij, bodo dehidrirane, saj se bo gradient vode prenašal na stran, kjer je večja koncentracija topljenih snovi. Če na drugi strani celice postavimo v hipotonični medij, bodo celice absorbirale tekočino, dokler jih ne lizirajo.

Zato se PBS pufer uporablja za laboratorijske protokole, ki zahtevajo vzdrževanje celic in vitro, na ta način celice ne bodo poškodovane.

PBS je sestavljen iz kombinacije soli, kot so natrijev klorid, natrijev fosfat, kalijev klorid in kalijev fosfat. Sestava PBS se lahko razlikuje glede na protokol.

Osnove

Funkcija fosfatnega pufra je v bistvu vzdrževanje konstantnega fiziološkega pH skupaj s koncentracijo elektrolita, podobno koncentraciji, ki jo najdemo v telesu.

V tem okolju so celice sposobne ostati stabilne, saj se čim bolj simulirajo fiziološka stanja.

V izvirno formulacijo PBS lahko po potrebi dodamo druge spojine, na primer dodajanje EDTA v pufer je koristno za pranje rdečih krvnih celic pri testu navzkrižne nezdružljivosti.

EDTA prepreči, da bi se del komplementa C1, ki je prisoten v serumu, cepil in liziral do rdečih krvnih celic, torej preprečuje lažne rezultate nezdružljivosti. Poleg tega EDTA pomaga ločiti celice.

Priprava

Količina soli, ki jo je treba pretehtati za pripravo fiziološke raztopine, ki je puferirana s PBS fosfatom, je odvisna od količine, ki jo je treba pripraviti:

-Fosfatna fiziološka raztopina (10X PBS)

Za en liter raztopine:

Tehtati:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Tehnika priprave

Težke soli dajte v čašo, dodajte dovolj vode (80%) in mešajte na mešalni plošči z magnetno palico, dokler se soli ne raztopijo.

Priprava PBS z mešalno ploščo z magnetno palico. Vir: Uporabnik: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrirajte, da odstranite neraztopljene delce. Uporabite filtre z 0,45 µm pore. Avtoklavirajte in aseptično porazdelite v laminarni nape v steklenih kozarcih s pokrovi.

10X raztopina (koncentrirana) ne prilagodi pH. Prilagoditev se opravi, ko je razredčena na 1X koncentracijo PBS pufera (razredčenje 1:10).

-Bufer fosfatna fiziološka raztopina (1X PBS)

1X PBS lahko pripravimo neposredno z tehtanjem ustreznih količin vsake soli ali pa ga pripravimo z redčenjem osnovne raztopine (1:10) s sterilno destilirano vodo.

-Za neposredno pripravo enega litra fiziološke raztopine 1X PBS fosfata stehtajte:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Tehnika priprave

Nadaljujemo, kot je razloženo v koncentrirani raztopini. Nato je treba pH prilagoditi. Če želite to narediti, izmerite pH in glede na rezultat uporabite kislino (HCl) ali bazo (NaOH), da po potrebi znižate ali povišate pH, dokler ta ne postane 7,4.

Kislina ali baza dodajamo kapljice po kapljico, medtem ko spremljamo pH vrednost raztopine s pomočjo pH metra. Filtrirajte, avtoklavirajte in po potrebi aseptično porazdelite v stožčaste epruvete ali kozarce.

- Za pripravo 1X PBS iz 10X osnovne raztopine:

Naredite 1:10 razredčitev. Na primer, da pripravimo 1 liter 1X PBS, izmerimo 100 ml osnovne raztopine in dodamo 700 ml sterilne destilirane vode. Prilagodite pH in napolnite količino vode do 1000 ml.

Pripravljen PBS pufer je brezbarven in prozoren.

Dnevno PBS lahko hranite pri sobni temperaturi, preostanek pa v hladilniku.

Raztopine za nastavitev pH

HCl

Za 100 ml 1 molarne HCL (klorovodikova kislina).

Izmerimo 91 ml destilirane vode in jo damo v 250-mililitrsko čašo.

Izmerite 8,62 ml koncentrirane HCl in jo počasi dodajte v čašo z vodo (nikoli ne delajte obratno). Pri ravnanju z močnimi kislinami (močno jedko snov) sprejmite ustrezne ukrepe biološke varnosti.

Mešajte 5 minut, po možnosti z mešalno ploščo z magnetno palico znotraj kozarca. V 100 ml bučko in dopolnimo do 100 ml z destilirano H ₂ O.

NaOH

Za 100 ml NaOH (natrijev hidroksid) 10 molarnih snovi.

Izmerite 40 ml destilirane vode in jo dajte v 250 ml čašo. Izmerite 40 g NaOH in dodajte v vodo. Z mešalno ploščo zmešajte magnetno palico znotraj kozarca.

Prenesemo v 100 ml bučko in dopolnimo z destilirano vodo do oznake. Upoštevajte predpise o biološki varnosti, ker je ta reakcija eksotermična (energijo sprošča v obliki toplote).

Če želite pripraviti še druge količine fiziološke raztopine, se lahko obrnete na naslednjo tabelo:

Vir: «Laboratorij za virusno in človeško genomiko, UASLP School of Medicine»

Prijave

Uporablja se predvsem v celični biologiji, imunologiji, imunohistokemiji, bakteriologiji, virologiji in raziskovalnih laboratorijih.

Idealen je za izpiranje celic s centrifugiranjem (rdeče krvne celice), pralnimi enoplastnimi celicami, v tehniki spektroskopske elipsometrije, pri količinskem določanju bakterijskih biofilmov, pri vzdrževanju celičnih kultur za viruse, kot čistilno raztopino v tehniki indirektne imunofluorescence. in v tehnikah za karakterizacijo monoklonskih protiteles.

Uporablja se tudi za prevoz celic ali tkiv, kot razredčilo za štetje celic, pripravo celičnih encimov (tripsin), kot razredčilo za metodo izsuševanja biomolekul in za pripravo drugih reagentov.

Na drugi strani so Martin et al. Leta 2006 dokazali, da je PBS uporaben v forenzičnih laboratorijih, zlasti pri obnavljanju semenčic iz vaginalnih razmazov ali pri obnavljanju vaginalnih celic iz razmazov penisa. Na ta način je mogoče ugotoviti, ali je prišlo do spolnega odnosa.

Omejitve

-Nekaj ​​PBS puferjev vsebuje konzervans snov, imenovano natrijev azid. Ta spojina lahko tvori eksplozivne snovi, če pride v stik s svincem ali bakrom. Zaradi tega je treba posebno paziti pri odstranjevanju tega reagenta skozi odtok. Če jo zavržemo na ta način, je treba dodati obilno vodo, da jo čim bolj razredčimo.

-Cink ne bi smeli dodajati fosfatnemu puferju, ker povzroči oborino nekaterih soli.

-Wangen in sodelavci v letu 2018 so ugotovili, da uporaba PBS ni primerna za pranje primarnih celic akutne mieloidne levkemije (AML), izločenih iz periferne krvi, zaradi dejstva, da se z lizo izgubi veliko celic z velikim zmanjšanjem materiala beljakovine.

Zato so ugotovili, da primarnih celic AML po shranjevanju v tekočem dušiku ne smemo sprati s PBS.

Reference

1. Coll J. (1993). Diagnostične tehnike v virologiji. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Celična kultura. Sprememba medija. Oddelek za normalno in patološko citologijo in histologijo Univerze v Sevilli. Na voljo na personal.us.es
3. Priprava fiziološko raztopine s fosfatom (PBS). (2008). Standardni operativni postopki (SOP) Laboratorij za človeško in virusno genomiko UASLP Medicinska šola. Dostopno na: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfatna pufrska sol." Wikipedija, prosta enciklopedija. 3. april 2019, 19:36 UTC 13. april 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Teme v molekularni biofiziki. Dostopno na: users.df.uba.ar
6. Rediar. Priročnik. PBS + EDTA. Dostopno na: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Uporaba fiziološke raztopine s fosfati za obnovo celic in semenčic iz brisov. Znanstvena pravičnost. 2006; 46 (3): 179–84. Na voljo v: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A in sod. Način konzerviranja in pranje s fiziološko raztopino s fosfatom vplivata na akutni mieloidni levkemija. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Na voljo v: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Teoretični in praktični temelji histokemije. Vrhunski svet za znanstvene raziskave. Madrid Dostopno na: books.google.co.ve