Agar TCBS je sredstvo za visoko selektivno in diferencialno trdnem kulture, ki se uporablja za izolacijo in gojenje bakterije iz rodu Vibrio, zlasti Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus in V. vulnificus kot glavnih povzročiteljev te vrste.
Kratica TCBS pomeni Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Ta agar je znan tudi kot selektivni medij za Vibrios. Prvotno formulo je ustvaril Nakanishi, kasneje pa jo je Kobayashi modificiral.
Komercialna TCBS medij in TCBS agar plošča, posejana z kolerabo Vibrio. Vir: fotografija 1: posnel avtor mag. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Indija
Sestavljen je iz izvlečka kvasa, mesnega peptona, tripteina, natrijevega citrata, natrijevega tiosulfata, oks žolča, saharoze, natrijevega klorida, železovega citrata, bromotimolno modrega, modrega timola in agarja.
Ta sestava omogoča primeren razvoj vrst Vibrio iz vzorcev vode, hrane in blata; z izjemo Vibrio hollisae, ki na tem gojišču ne raste. Poleg tega je medij TCBS sposoben zavirati rast drugih spremljajočih bakterij, zlasti koliform.
Zaradi resnih težav s prebavili in črevesjem, ki jih proizvajajo nekatere vrste rodu Vibrio, je njegova diagnoza zelo pomembna. Ljudje se v glavnem okužijo z uživanjem surove ali prekuhane hrane iz morja ali onesnaženih voda, lahko pa tudi z okužbo ran.
Zaradi tega morajo klinični laboratoriji vključiti TCBS agar v študijo o kulturi blata vzorcev tekočega blata, zlasti ob pojavu riževe vode. Še posebej, če bolnik poroča, da je bil v stiku z morsko vodo ali da je zaužil školjke ali ribe.
Osnove
Izvleček kvasa, mesni peptoni in triptein so prehranski vir tega medija. Vendar je TCBS agar negostljiv medij za večino bakterij.
Njegova visoka selektivnost je dana z dodatkom natrijevega citrata in vola žolča; oba sta zaviralna sredstva, ki zagotavljajo tudi alkalni pH v mediju, omejujejo rast spremljajoče flore in spodbujajo rast V. kolere med drugimi vrstami. Treba je opozoriti, da je koleraba Vibrio zelo občutljiva na kislost.
Natrijev klorid osmotsko uravnava medij. Ker je njegova koncentracija visoka, deluje tudi kot zaviralno sredstvo, kar spodbuja rast halofilnih bakterij.
Saharoza je fermentirajoči sladkor, ki skupaj z bromothymol modrim in timol modrim pH indikatorjem dajeta mediju svoj različen značaj. Zaradi tega je s tem medijem mogoče razlikovati fermentirajoče sekve saharoze od ne fermentirajočih.
Kolonije fermentirajočih sevov saharoze razvijejo rumeno barvo in bodo zaradi tvorbe kislin medij postale zelene v rumene. Ne-fermentorji postanejo prosojni, medij pa ostane prvotna barva (zelena).
Prav tako ta medij vsebuje natrijev tiosulfat kot vir žvepla in železov citrat kot sredstvo za razvijanje. Obe kažeta bakterije, ki lahko proizvajajo vodikov sulfid (brezbarven plin). H 2 S tvorjen iz tiosulfata in nato na reakcijo z železovim citratom vidnem črno oborina.
In nazadnje, agar je tisto, kar daje trdni konsistenci medij.
Priprava
Odtehtamo 89 g dehidriranega medija in ga raztopimo v enem litru destilirane vode. Pomagajte raztapljanju s segrevanjem in pogostim mešanjem. Zmes lahko vremo do 2 minuti.
Ta medij ni samodejno klaviran. Po raztapljanju ga postrežemo neposredno na sterilnih krožnikih. Ko se strdijo, jih na obrnjen način razporedimo po trombocitih in do uporabe hranimo v hladilniku (2-8 ° C).
Medij po pripravi mora ostati pri pH 8,6 ± 0,2.
Barva dehidriranega medija je svetlo bež ali zelenkasto-bež, barva medija pa je gozdno zelena ali modrikasto zelena.
Pred setvijo vzorcev je pomembno, da se plošče segrejejo.
Uporaba
Najpogostejši vzorec za izolacijo Vibrios je driskani stolček.
Če vzorcev blata ni mogoče takoj posejati na selektivni medij, je treba prevažati na gojišču Cary Blair.
Da bi povečali občutljivost kulture, lahko iztrebke skozi olje peptona pri pH 8,4 kot obogatitveni medij prepustimo za največ 8 ur, od tam pa ga subkultiviramo v medij TCBS.
Upoštevati je treba tudi, da lahko nekateri sevi virusa povzročijo septikemijo pri imunosupresivnih bolnikih, zato jih lahko izoliramo iz krvnih kultur. Prav tako se lahko analizirajo vzorci vode in hrane iz morja, kadar pride do epidemije kolere.
Posejano
Inokulum študijskega vzorca mora biti izstopajoč, setev se izvaja po metodi odstranjevanja z izčrpanjem. Plošče se 24 ur inkubirajo pri aerobiozi pri 37 ° C.
Domnevne kolonije vibrio kolere so srednje velikosti, gladke, neprozorne, s tankimi obrobi in rumene barve zaradi fermentacije saharoze.
Na podoben način rastejo vrste V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii in nekaj V. vulnificus. Druge klinično pomembne vrste Vibrios, kot je V. parahaemolyticus, ne fermentirajo saharoze in se razvijajo kot oljčno zelene kolonije.
TCBS agar plošča, posejana z Vibrio parahaemolyticus. Vir: isis325 Flickr
Po drugi strani je treba upoštevati, da lahko nekateri sevi Aeromonas in Plesiomonas, ki so oksidaza (+), rastejo v tem mediju in razvijejo rumene kolonije, ki klinika lahko zmedejo. Medtem ko nekateri sevi Pseudomonas tudi oksidaze (+) rastejo kot zelene kolonije, kot je V. parahaemolyticus.
Omejitev
Test oksidaze, ki je pozitiven za rod Vibrio, ne sme biti nikoli izveden iz kolonij, pridobljenih iz TCAR agarja, saj bo dobljeni rezultat lažno negativen. Spojine na sredini močno ovirajo ta test. Zato mora biti narejena iz subkultur na krvnem agarju.
QA
Da bi dokazali, da je gojišče v dobrem stanju, je priporočljivo posejati znane ali certificirane kontrolne seve in opazovati, če rast ustreza pričakovanim značilnostim.
Za to lahko uporabite seve:
-Vibrio kolere - zadovoljiva rast (rumene kolonije, prosojna meja).
-Vibrio parahaemolyticus - - zadovoljiva rast (kolonija z zeleno sredino in prosojno mejo).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - zadovoljiva rast (rumene kolonije s halosi iste barve okoli kolonije).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - popolna ali delna inhibicija (majhne rumene ali prosojne kolonije).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853- - delna ali popolna inhibicija (modre kolonije).
-Escherichia coli ATCC 25922 - popolnoma zavira.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– popolna ali delna inhibicija. (Majhne kolonije prosojna meja zelene sredine).
Inkubacija neinokuliranega medija mora biti nespremenjena.
Reference
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. TCBS agar. 2009.Na voljo na: f-soria.es
- BD Laboratorij. BD. TCBS Agar 2003. Dostopno na: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS srednje. 2015. Dostopno na: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. TCBS Agar. 2016. Dostopno na naslovu: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.