KRVNI AGAR: UTEMELJITEV, UPORABA IN PRIPRAVA - BIOLOGIJA - 2026

Krvnem agarju je trdno gojišče obogatena razlika vendar neselektivna. Uporablja se za obnovo in rast številnih mikroorganizmov iz kliničnih vzorcev ali za subkulture.

Klasični krvni agar je treba vključiti za sejanje večine kliničnih vzorcev, prejetih v laboratoriju; razen za vzorce blata, kadar ni uporaben, razen če so pripravljeni z določenimi spremembami.

Plošča s krvnim agarjem

To gojišče v osnovi sestoji iz obogatenega baznega agarja in 5% krvi. Osnova agarja se lahko razlikuje glede na potrebe, v glavnem pa ga bodo sestavljali peptoni, aminokisline, vitamini, mesni ekstrakt, natrijev klorid, agar.

Kar zadeva kri, je običajno potreben stik z vivarijem za pridobivanje krvi živali, kot so ovce, zajec ali konj. Vendar to ni vedno mogoče in človeška kri se včasih uporablja.

Gojišče s krvnim agarjem lahko pripravimo v laboratoriju ali ga kupimo že pripravljeno v specializiranih podjetjih. Priprava tega medija je ena najbolj občutljivih, vsaka nepazljivost pri njegovi pripravi bo povzročila onesnaženo serijo.

Zato je treba sprejeti vse možne varnostne ukrepe in na koncu je treba opraviti kontrolo kakovosti z inkubiranjem pri 37 ° C 1 plošči na vsakih 100 pripravljenih.

Osnove

Staphylococcus aureus gojijo na krvnem agarju. Nathan Reading na Flickr Nathan R. na Twitterju, prek Wikimedia Commons Že omenjeno je, da ima krvni agar lastnost obogatenega, diferencialnega in neselektivnega gojišča. Spodaj je razložena osnova za vsako od teh lastnosti.

Krvni agar je obogateno gojišče, saj vsebuje 5-10% krvi na osnovi agarja kot njegov glavni dodatek. Obe spojini vsebujeta veliko hranilnih snovi, ta lastnost pa omogoča, da v njej raste večino obdelovalnih bakterij.

Rast poteka brez omejitev; zaradi tega ni selektivna. Če pa temu medu dodamo spojine, ki preprečujejo rast nekaterih mikroorganizmov in dajejo prednost drugim, postane selektivna. Tako je, če dodamo nekatere vrste antibiotikov ali protiglivičnih zdravil.

Prav tako je krvni agar diferencialni medij, saj nam omogoča razlikovati 3 vrste bakterij: beta-hemolitične, alfa-hemolitične in gama-hemolitične.

Beta-hemolitiki so tisti, ki imajo sposobnost, da popolnoma lizirajo ali razbijejo rdeče krvne celice, kar tvori jasno halo okoli kolonij, zato proizvajajo ß ali ß-hemolizo in mikroorganizme imenujemo ß-hemolitični.

Primera ß-hemolitičnih bakterij sta Streptococcus pyogenes in Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolitiki so tisti, ki izvajajo delno hemolizo, pri čemer se hemoglobin oksidira v methemoglobin in ustvari zelenkasto obarvanje okoli kolonij. Ta pojav poznamo kot α ali α-hemolizo in bakterije uvrščamo med α - hemolitične.

Primera α-hemolitičnih bakterij sta Streptococcus pneumoniae in Streptococcus iz skupine viridans.

Končno obstajajo tako imenovane gama-hemolitične ali ne-hemolitične bakterije. Te rastejo na agaru, ne da bi na njem nastale spremembe, učinek znan kot γ-hemoliza, mikroorganizmi pa so γ-hemolitični.

Primer γ-hemolitičnih bakterij: nekateri sevi streptokoka skupine D (Streptococcus bovis in Enterococcus faecalis).

Prijave

Medij za gojenje krvnih agarjev je eden najpogosteje uporabljenih v mikrobiološkem laboratoriju.

Med mikroorganizmi, ki lahko rastejo na gojišču krvnega agarja, so: stroga aerobna, fakultativna, mikroaerofilna, anaerobna, grampozitivna ali gram-negativna bakterija, hitro rastoče ali počasi rastoče bakterije.

Rastejo tudi nekatere prehransko zahtevne ali prekomerne bakterije, pa tudi glive in kvasovke. Prav tako je koristen za subkultiviranje ali reaktiviranje sevov, ki so presnovno zelo šibki.

Izbira krvne skupine in baznega agarja pa bo odvisna od verjetnega mikroorganizma, pri katerem se sumi, da se bo okreval, in od uporabe, na kateri se plošča uporablja (kultura ali antibiogram).

Izbira krvne skupine

Kri je lahko jagnjetina, zajec, konj ali človek.

Najbolj priporočljiva je kri jagnjetine, z nekaj izjemami. Na primer za izolacijo vrste Haemophilus, kjer je priporočena kri konjska ali zajčja kri, saj jagnjetina vsebuje encime, ki zavirajo faktor V.

Najmanj priporočljiv je človek, vendar se ga najbolj uporablja, morda zato, ker ga je najlažje dobiti.

Kri mora biti defibrinirana, pridobljena brez kakršnih koli dodatkov in od zdravih živali. Za uporabo človeške krvi je treba upoštevati več dejavnikov:

Če kri prihaja od posameznikov, ki so imeli bakterijske okužbe, bodo imela specifična protitelesa. V teh pogojih je rast nekaterih bakterij verjetno zavirana.

Če ga dobimo iz krvne banke, vsebuje citrat in nekatere bakterije morda ne rastejo v njegovi prisotnosti. Po drugi strani, če kri prihaja od bolnikov, ki jemljejo antibiotike, lahko rast občutljivih bakterij zavira.

In če je kri sladkorne osebe, presežek glukoze moti pravilen razvoj vzorcev hemolize.

Izbira vrste osnovnega agarja

Bazni agar, ki se uporablja za pripravo krvnega agarja, je lahko zelo širok. Med njimi so: hranilni agar, agar za infundiranje možganskega srca, sojin agar triptilicaze, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agrum Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter itd.

Uporaba krvnega agarja glede na osnovni medij, uporabljen za njegovo pripravo

Hranilni agar

Ta osnova je najmanj uporabljena, saj bodo v njej gojile predvsem nezahtevne bakterije, kot so enterični bacili, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp. Ni priporočljivo izolirati streptokoka.

Infuzija možganskega srca Agar (BHI)

Je ena izmed najbolj uporabljenih kot osnova za krvni agar, saj ima potrebna hranila za rast večine bakterij, vključno s Streptococcus sp in drugimi zahtevnimi bakterijami. Čeprav ni primerno opazovati vzorcev hemolize.

Jagnječeva kri se na splošno uporablja s to osnovo.

Pripravimo lahko tudi variante krvnega agarja, kjer dodamo druge spojine za izolacijo določenih mikroorganizmov. Na primer, za izolacijo Francisella tularensis se lahko uporabi Agar z možgansko infuzijo, dopolnjeno s kunčjo krvjo, cistinom in glukozo.

S cistinskim teluritom je koristen za izolacijo Corynebacterium diphteriae. Lahko se uporablja človeška ali jagnjetina kri.

S prvo beta-hemolizo bomo videli kot ozek halo, z drugim pa halo veliko širši.

Prav tako se ta baza skupaj z bakitracinom, koruznim škrobom, konjsko krvjo in drugimi dodatki za obogatitev (IsoVitaleX) uporablja za izolacijo rodu Haemophilus sp iz dihalnih vzorcev.

Tudi če dodamo kombinacijo antibiotikov kloramfenikol - gentamicin ali penicilin - streptomicin s konjsko krvjo, je idealen za izolacijo zahtevnih patogenih gliv, tudi z večjim donosom kot agon Sabouraud glukoze. Še posebej je koristen pri izolaciji Histoplasma capsulatum.

Tripticazni sojin agar

Ta osnova je najbolj priporočljiva za boljše opazovanje vzorca hemolize in za izvajanje diagnostičnih testov, kot sta takto optokina in bacitracin. To je klasični krvni agar, ki se uporablja rutinsko.

S to osnovo lahko pripravite tudi poseben krvni agar za Corynebacterium diphteriae, s cistinskim teluritom in jagnjetino krvjo .

Prav tako je kombinacija tega agarja z jagnječino krvjo in kanamicin-vankomicin idealna za rast anaerob, zlasti Bacteroides sp.

Müeller Hinton agar

Ta osnova, dopolnjena s krvjo, se uporablja za izvajanje antibiograma hitrih mikroorganizmov, kot je Streptococcus sp.

Koristna je tudi za izolacijo bakterij, kot je Legionella pneumophila.

Thayer Martin Agar

Ta medij je idealen kot osnova za krvni agar, kadar obstaja sum na rod Neisseria, zlasti Neisseria meningitidis, saj N. gonorrhoeae ne raste na krvnem agarju.

Uporablja se tudi za testiranje občutljivosti na Neisseria meningitidis.

Columbia agar

Ta osnova je odlična za sejanje vzorcev biopsije želodca za Helicobacter pylori.

Medij pripravimo tako, da dodamo 7% jagnječje krvi, defibrinirane z antibiotiki (vankomicin, trimetoprim, amfotericin B in cefsulodin), da omejimo rast drugih vrst bakterij, ki so lahko prisotne.

Ta ista osnova, dopolnjena s človeško ali jagnjetinsko krvjo, nalidiksično kislino in kolistinom, je uporabna za izolacijo Gardnerella vaginalis. Idealen je tudi za oceno protimikrobne dovzetnosti za antibiotike istega mikroorganizma.

Poleg tega se uporablja za pripravo krvnega agarja za kulturo anaerob, pri čemer dodamo aminoglikozide in vankomicin.

Ta osnova omogoča pravilno opazovanje vzorcev hemolize.

Brucella agar

Ta medij, ki se uporablja kot osnova za krvni agar skupaj z dodatkom vitamina K, je idealen za gojenje anaerobnih bakterij. V tem primeru je priporočljiva uporaba krvi jagnjetine.

Campylobacter agar

Campylobacter agar, dopolnjen s 5% ovčje krvi in ​​5 antibiotiki (cefalothin, amfotericin B, trimetoprim, polimiksin B in vankomicin) je medij, ki se uporablja za izolacijo Campylobacter jejuni v vzorcih blata.

Priprava

Vsaka trgovska hiša vsebuje navodila, da na zadnji strani posode pripravijo liter gojišča. Ustrezni izračuni se lahko pripravijo za pripravo želene količine, odvisno od izbranega osnovnega agarja.

Odtehtamo in raztopimo

Osnovni agar je dehidriran (v prahu), zato ga je treba raztopiti v destilirani vodi, nastavljeni na pH 7,3.

Količino, ki jo navede izbrani bazni agar, stehtamo in raztopimo v ustrezni količini vode v bučki, nato segrevamo na zmerni vročini in mešamo z rotacijskimi gibi, dokler se ves prah ne raztopi.

Sterilizirajte

Ko se raztopi, sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C 20 minut.

Krvni agregat

Ko pustite avtoklav, bučko pustite, da se ohladi, dokler se temperatura ne giblje med 40 in 50 ° C; Gre za temperaturo, ki jo človeška koža podpira, hkrati pa agar še ni utrjen.

Da bi to naredili, se bučko dotaknemo z roko in če je toplota prenašalna, je idealna temperatura, da dodamo ustrezno količino defibrificirane krvi (50 ml na vsak liter agarja). Nežno premešamo, da se homogenizira.

Pretekanje agregacije krvi je ključnega pomena, ker se rdeče krvne celice, če se izvede, ko je medij zelo vroč, razgradijo in medij ne bo uporabljen za opazovanje hemolize.

Če ga dodamo prehladno, se bo zgrudil, površina medija pa ne bo gladka, kar bi omogočilo pravilno ocenjevanje.

Vlijemo v Petrijeve jedi

Postrezite v sterilnih petrijevih posodah takoj po homogenizaciji krvi. V vsako Petrijevo posodo vlijemo približno 20 ml. Ta postopek se izvede v pokrovu laminarnega toka ali v bližini gorilnika.

Ko servirate krvni agar v petrijevih posodah, na površini plošče ne smejo ostati zračni mehurčki. Če se to zgodi, se plamen gorilnika Bunsen hitro prenese čez ploščo, da jih odpravi.

Plošče pustimo, da se strdijo in shranijo v hladilnik (2-8 ° C), obrnjen do uporabe. Pred uporabo plošč za krvni agar jih je treba kaljeti (pustiti, da dosežejo sobno temperaturo), da jih je mogoče sejati.

Pripravljene plošče trajajo približno 1 teden.

Reference

1. Bayona M. Mikrobiološki pogoji za kulturo Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94–99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktična klinična mikrobiologija. University of Cadiz, 2. izdaja UCA Služba za publikacije.
3. "Krvni agar." Wikipedija, prosta enciklopedija. 10. december 2018, 14:55 UTC 27. december 2018, 01:49 en.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Argentina. Uredništvo Panamericana SA
5. CEDIVET Laboratorijski veterinarski diagnostični center. Gvatemala Dostopno na: trensa.com.
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA