AGAR MRS: TEMELJ, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Agar MRS je selektivni trdnem mediju kulture uporabimo za izolacijo in ugotavljanje števila mlečnokislinskih bakterij, zlasti iz rodu Lactobacillus. Ta agar so leta 1960 ustvarili Man, Rogosa in Sharpe, ki nosi isto ime, vendar se zaradi njegove zapletenosti pogosto uporablja kratica MRS.

Sestavljen je iz proteoznega peptona, izvlečka mesa, izvlečka kvasa, glukoze, sorbitan monoleat, dikalijevega fosfata, natrijevega acetata, amonijevega citrata, magnezijevega sulfata, manganovega sulfata in agarja.

Man Rogosa in Sharpe Agar (MRS), posejani z Lactobacillus sp. Vir: Fotografijo, ki so jo za ta članek podarili avtorji: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Fotografija, posneta med preiskavo z naslovom: Ocena mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij s probiotičnim potencialom v materinem mleku in dojenčkih .

Ta sestava omogoča pravilen razvoj mlečnokislinskih bakterij iz kliničnih vzorcev, kot so iztrebki, izcedek iz nožnice, ustni vzorci in materino mleko, pa tudi mlečna in mesna hrana.

V kliničnih laboratorijih se ne uporablja rutinsko, saj mlečnokislinske bakterije redko sodelujejo v bolezenskih procesih. Toda na področju mikrobiologije živil je uporaba MRS agarja pogostejša.

Po drugi strani ta medij uporabljajo nekateri raziskovalni centri, katerih cilj je preučevanje mlečnokislinskih bakterij.

Osnove

Man, Rogosa in Sharpe agar ima precej zapleteno sestavo. Z razčlenitvijo funkcije vsake njene komponente je mogoče razložiti njen temelj.

Proteinski pepton, mesni ekstrakt, ekstrakt kvasa in glukoza so hranila, ki zagotavljajo vir ogljika, dušika, vitaminov in mineralov, potrebnih za rast bakterij. Poleg tega je glukoza univerzalni vir energije, ki se uporablja v večini kulturnih medijev.

Po drugi strani pa je za spodbujanje rasti mlečnokislinskih bakterij potrebna prisotnost kofaktorjev (kationov), ki so nujni pri presnovi laktobacilnih in sorodnih bakterij; Te spojine so natrijeva, magnezijeva in manganova sol.

Tudi sorbitan monoleat ali polisorbat 80 sta pomemben vir maščobnih kislin, saj se absorbirajo kot hranila.

Poleg tega sorbitan monoleat in amonijev citrat delujeta tako, da zavirata razvoj spremljajoče flore, zlasti gram negativnih bakterij, kar zagotavlja selektivni značaj tega agarja.

Končno je agar-agar tisti, ki daje trdno konsistenco mediju.

Obstajajo tudi druge različice agarja Man Rogosa Sharpe; eden od njih je dopolnjen s cisteinom (MRSc), zelo uporabnim za izolacijo bifidobakterij, med drugimi mikroorganizmi. Na drugi strani je medij MRS, dopolnjen z neomicinom, paromomicinom, nalidiksično kislino in litijevim kloridom, poseben za selektivno štetje bifidobakterij v mlečnih izdelkih.

Priprava

Odtehtamo 68,25 grama dehidriranega medija in ga raztopimo v enem litru destilirane vode. Pustite stati 5 minut. Da se popolnoma raztopi, obrnite na vir toplote, pogosto mešajte in kuhajte 1 do 2 minuti. Sterilizirajte 15 minut v avtoklavu pri 121 ° C.

Ko zapustite avtoklav, pustite stati nekaj minut in ga še vedno vroče porazdelite po sterilnih petrijevih posodah.

Pustite, da se plošče strdijo in obrnejo, jih naročite po nosilnih ploščah in hladite do uporabe. Pustite, da se plošče pred uporabo segrejejo na sobno temperaturo.

PH medija mora biti 6,4 ± 0,2. Nekatere poslovne hiše priporočajo pH med 5,5 do 5,9.

Dehidriran medij je bež barve, pripravljen pa je temno jantarne barve.

Tako dehidrirani medij kot pripravljene plošče je treba hraniti pri 2-8 ° C.

Prijave

Plošče z agarjem MRS se lahko sejejo na površino (izčrpanost ali Drigalski lopatico). Lahko se seje tudi po globini. Plošče je treba inkubirati pri 37 ° C v mikroaerofilnosti (4% O ₂ in 5-10% CO ₂ ) 24 do 72 ur.

Način setve se izbere glede na namen, ki ga sledijo (izolacija ali štetje).

Značilnosti kolonij

Domnevne kolonije bakterije Lactobacillus imajo belkasto barvo in imajo na tem agarju mukoidni ali kremasti videz. Pozneje jih je treba identificirati.

Izolacija mlečnokislinskih bakterij

Za to se uporablja površinsko sejanje. Za vzorčenje, ki ga je treba posejati, je potreben predhodni postopek.

Pri vzorcih materinega mleka je priporočljivo centrifugirati 1 ml vzorca pri 14.000 vrt./min 10 minut, da se odstrani maščobna plast. 900 μl se zavrže, preostalih 100 µl pa se usedlina suspendira in vlije na površino agarja MRS, ki jo nato enakomerno porazdeli z Drigalski lopatico.

V primeru vzorcev blata se en (1) gram blata stehta in homogenizira v 9 ml 0,1% sterilne peptonske vode, kar ustreza razredčitvi 1/10. Nato naredimo serijska redčenja, dokler ne dobimo končnega redčenja 10 ^-4 .

Na koncu se odvzame 100 μl razredčitev 10 ^-2 , 10 ^-3 in 10 ^-4 in vsako razredčenje seme na agar MRS, ki se enakomerno porazdeli z lopatico Drigalski.

Mlečnokislinske bakterije štejejo

V tem primeru setev opravi po globini.

Za vzorce materinega mleka se odvzame 1 ml in se postavi v sterilno konusno plastično cev. MRS agar dodamo pri približni temperaturi 40 ° C do končne prostornine 25 ml, pri čemer dobimo homogeno zmes. Nato se enakomerno vlije v sterilne Petrijeve posode in pusti stati do polimerizacije.

Za vzorce blatu naredimo redčenja, kot je predhodno opisano. Vsako razredčenje vzemite 1 ml in ga položite v sterilne plastične epruvete. Staljeni MRS agar dodamo v prostornini 25 ml.

Zmes vsakega redčenja enakomerno vlijemo v sterilne Petrijeve posode. Na koncu ga pustimo počivati ​​do polimerizacije.

Kolonije štejejo na agarju Man Rogosa in Sharpe (MRS). Vir: Fotografija je podarjena za ta članek. Avtorji: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Fotografija, posneta med raziskavo z naslovom: Vrednotenje mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij s probiotičnim potencialom v materinem mleku in dojenčkih.

Raven raziskav

Vsak dan je proučevanje mlečnokislinskih bakterij vedno več zanimanja; Raziskovalci si med drugim prizadevajo, da bi med drugim uporabili nove seve in njihov potencial kot zaganjalna fermentacija za standardizacijo pri proizvodnji mlečnih izdelkov.

V tem smislu sta Alvarado in sod. (2007) so uporabili agar MRS za izvedbo študije, v kateri so izolirali, identificirali in okarakterizirali mlečnokislinske bakterije, prisotne v obrtnem andskem dimljenem venezuelskem siru.

V siru so ugotovili prisotnost bakterij rodov Lactococcus in Lactobacillus in ugotovili, da so mešanice izoliranih sevov primerne kot začetni sevi pri proizvodnji sirov iz pasteriziranega mleka.

Po drugi strani pa Sánchez in sod. (2017) so uporabili agar MRS za raziskavo prisotnosti mlečnokislinskih bakterij v prebavnem traktu pujskov, da bi jih uporabili kot naravne probiotike, ki povečajo produktivnost zdravih pujskov.

S tem medijem jim je uspelo izolirati štiri vrste: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae in Pediococcus pentosaceus.

Prav tako Báez et al. (2019) so uporabili agar MRS za oceno mlečnokislinskih bakterij (LAB) in bifidobakterij s probiotičnim potencialom v materinem mleku in dojenčkih.

Uspeli so izolirati 11 BAL in 3 Bifidobacteria sp v materinem mleku ter 8 BAL in 2 Bifidobacteria sp. v blatu. Vsi so izpolnjevali določene parametre, ki jih dokazujejo kot bakterije s probiotično aktivnostjo.

Avtorja sta sklenila, da tako materino mleko kot zalege izključno dojenih dojenčkov služijo kot naravni viri probiotičnih bakterij.

QA

Za ocenjevanje kakovosti MRS agarja kontroliramo seve, kot so:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli in Bacillus cerei.

Pričakovani rezultati so za prvih 6 bakterij zadovoljivi, medtem ko je treba E. coli in Bacillus cereus popolnoma zavreti.

Reference

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolacija, identifikacija in karakterizacija bakterij mlečne kisline iz venezuelskega prekajenega andskega umetnega sira. Njegova uporaba kot zacetna kultura. Cient. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301–308. Dostopno na: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Izolacija bakterij mlečne kisline iz prebavnega trakta pujske. Rev. veterinar. Peru 2017; 28 (3): 730–736. Dostopno na: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Vrednotenje mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij s probiotičnim potencialom v materinem mleku in iztrebkih dojenčkov v občini Acevedo, Miranda 2017. Dodiplomsko delo za pridobitev izobrazbe za doktorat Bioanaliza. University of Carabobo, Venezuela.
4. Britannia Laboratory. MRS agar. 2015. Dostopno na: britanialab.com
5. Sodelavci Wikipedije. MRS agar. Wikipedija, prosta enciklopedija. 10. januar 2018, 19:44 UTC. Dostopno na: wikipedia.org Dostopano 17. februarja 2019.
6. Roy D. Mediji za izolacijo in naštevanje bifidobakterij v mlečnih izdelkih. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167–82.