STANDARDNA AGARNA KROGLICA: UTEMELJITEV, PRIPRAVA IN UPORABA - BIOLOGIJA - 2026

Standard agar število je trdna, neselektivno gojišče, ki so namenjeni za kvantifikacijo aerobne obremenitve trenutno mikrobne v vzorcih pitne vode, odpadne vode, mlečnih pijač, med drugimi živili. Ta medij je znan tudi kot agar PCA, zaradi njegove kratice v angleškem jeziku Plate Count Agar. Ustvarili so ga leta 1953 s strani Buchbinderja, Barisa in Goldsteina.

Standardno agarno sredstvo za štetje je sestavljeno iz ekstrakta kvasa, tripteina, glukoze, agarja in destilirane vode. Ta formulacija vsebuje osnovne prehranske elemente, ki omogočajo razvoj sedanje aerobne mikrobne obremenitve, ki ni zahtevna.

Decimalna redčenja za štetje CFU-jev v standardnih štetjih agarjev. Vir: Quentin Geissmann

Ker medij ne vsebuje zaviralcev, lahko bakterije rastejo brez kakršnih koli omejitev, zato je idealen za splošno štetje kolonij. Vendar s tehniko kvantifikacije plošč ne bomo zaznali vseh prisotnih bakterij, temveč le tiste, ki lahko rastejo v okoljskih pogojih, ki jim je podvržen semenski standardni števec.

V tem smislu s tehniko kvantifikacije plošč na splošno skuša določiti količino bakterij aerobnega mezofilnega tipa, torej tistih, ki se razvijejo pri temperaturah med 25 in 40 ° C, z optimalno rastno temperaturo 37 ° C. .

Ta bakterijska skupina je zelo pomembna, saj se tam najde večina patogenih bakterij za človeka.

Upoštevati je treba, da je včasih zanimivo količinsko določiti količino psihrofičnih bakterij, ki so prisotne v hrani. Te bakterije so tiste, ki rastejo pri nizkih temperaturah (<20 ° C) in so odgovorne za to, da se hrana hitreje razgradi, tudi ko je ohlajena.

Prav tako so lahko termofilne bakterije, ki se razvijejo v območju med 50 ° C in 80 ° C ali več, pomembne pri nekaterih vrstah hrane, kot so konzervirana živila.

Kvantifikacija mikrob je izražena v enotah, ki tvorijo kolonije (CFU) na gram ali mililiter vzorca.

Osnove

Standardni medij za štetje je zasnovan tako, da omogoča uspešno rast nehitrih aerobnih bakterij, kot so ekstrakt kvasa, triptein in glukoza, ki zagotavljajo potrebna hranila za dobro rast mikrobov.

Na drugi strani ima medij svetlo barvo in prozoren videz, zato je idealen za vizualizacijo kolonij, razvitih z metodo globokega sejanja (vlivanje v krožnik).

Možno je tudi štetje kolonij po metodi sejanja površinske lopatice Drigalski.

Kadar je mikrobna obremenitev velika, je treba opraviti decimalna redčenja vzorca, da lahko štejemo CFU.

Treba je opozoriti, da ta medij priporoča Ameriško združenje za javno zdravje (APHA) za število aerobnih mezofilov.

Priprava

Natehtamo 23,5 g dehidriranega medija in raztopimo v litru destilirane vode. Da se popolnoma raztopi, je treba mešanico segrevati s pogostim mešanjem, dokler ne zavre. Nadaljnji koraki so odvisni od tehnike sejanja, ki se uporablja.

Za tehniko nalivanja plošč

Porazdelite ga z 12 do 15 ml v epruvete. Nato se sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C 15 minut. Pustite, da se strdi navpično v obliki bloka. Shranjujte v hladilniku do uporabe.

Ko jo boste uporabljali, stopite čep. Ko se stopi, jo hranite v vodni kopeli pri 44-47 ° C, medtem ko se vzorci pripravijo.

Za površinsko setev

Medij sterilizirajte v avtoklavu pri 121 ° C in nato porazdelite 20 ml v sterilne Petrijeve posode. Pustite, da se strdi, obrnite in hranite v hladilniku do uporabe.

Pred uporabo se uporabijo plošče za temperiranje. PH medija mora biti 7,0 ± 0,2.

Uporaba

Standardni števec Agar se uporablja v tehniki aerobnega mezofilnega štetja med mikrobiološko analizo vode in hrane. Število aerobnih mezofilov je potrebno, saj določa sanitarno kakovost vzorca.

Uporaba te tehnike (z uporabo tega medija) omogoča makroskopsko vizualizacijo izoliranih kolonij za njihovo kvantifikacijo.

Tehnika vlivanja plošč (globinsko sejanje)

-Proces

Tehnika je sestavljena iz naslednjega:

1) Homogenizirajte vzorec, da prerazporedite prisotne bakterije.

2) Začetna suspenzija se naredi v sterilni steklenici ali vrečki, pri čemer se upošteva razmerje 10 gr ali 10 ml vzorca v 90 ml razredčila (10 ^-1 ).

3) Od začetne suspenzije se naredijo ustrezna decimalna redčenja, odvisno od vrste vzorca. Primer: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Redčenja se izvedejo z vodnim pufrom iz peptona ali fosfatom.

Če želite to narediti, vzemite 1 ml začetne suspenzije in jo položite v 9 ml razredčila, po potrebi nadaljujte z redčenjem, tako da jemljete 1 ml redčenja 10 ^-2 in tako naprej.

4) Vzemite 1 ml vsake razredčitve in postavite v prazne sterilne Petrijeve posode.

5) V vsako ploščo dodajte 12 do 15 ml standardnega agarja, ki je bil predhodno stopljen in naseljen pri 44 - 47 ° C.

6) Plošče nežno zasukajte, da se vzorec vzdolž agarja enakomerno porazdeli in pustite, da se strdi.

7) Plošče obrnite in 24 do 48 ur pri aerobiozi inkubirajte pri 37 ° C.

8) Ob koncu časa se plošče pregledajo in kolonije štejejo v razredčenju, ki to omogoča. Za štetje so izbrane tiste plošče, ki imajo od 30 do 300 CFU.

Štetje je mogoče ročno ali pa uporabite opremo števca kolonije.

Dovoljene vrednosti na ml vzorca se lahko razlikujejo od države do države, odvisno od predpisov, na katere se nanašajo.

-Izračun UFC

Splošni izračun se izvede po naslednji formuli:

Formula za splošni izračun količinske določitve CFU-jev. Vir: Nacionalna uprava za zdravila, hrano in medicinsko tehnologijo (ANMAT). Mikrobiološka analiza hrane, uradna analitična metodologija, indikatorski mikroorganizmi. Letnik 3. leto 2014 Na voljo na: anmat.gov.ar

Rezultate izrazite v 1 ali 2 števki, pomnožite z ustrezno osnovo 10. Primer: če je rezultat 16.545, se zaokroži na podlagi tretje številke na 17.000 in se izrazi na naslednji način: 1,7 x 10 ⁴ . Če bi bil rezultat 16.436, ga zaokrožite na 16.000 in izrazite 1,6 x 10 ⁴ .

Tehnika površinskega sejanja

-Proces

-Inokularno z 0,1 ml neposrednega vzorca, če je tekoč, začetna suspenzija 10 ^-1 ali zaporedna redčenja 10 ^-2 , 10 ^-3 itd na sredini plošče standardnega števnega agarja.

- Vzorec enakomerno porazdelite z lopatico Drigalski ali stekleno palico v obliki črke L. Pustite počivati ​​10 minut.

- ploščo obrnite in aerobno inkubirajte 24 do 48 ur pri 37 ° C.

-Pri nadaljevanju štetja kolonij izberite tiste plošče, ki so v območju med 20 in 250 CFU.

-Izračun UFC

Za izračun se uporabi faktor redčenja, ki je obratno. Število je zaokroženo na dve pomembni števki (zaokroževanje po tretji številki) in izraženo z močjo baze 10. Na primer, če se v vzorcu šteje 224 CFU brez redčenja (10 ^-1 ), se navede 22 x 10 ¹ CFU , če pa je bila vrednost 225, poročajo o 23 x 10 ¹ CFU.

Če se pri redčenju 10 ^-3 šteje 199 CFU, se bo poročalo o 20 x 10 ⁴ CFU, če pa se v enakem razredčenju šteje 153 CFU, se poroča o 15 x 10 ⁴ CFU.

QA

Standardni medij za kulturo štetja je mogoče oceniti z uporabo znanih certificiranih sevov, kot so: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Če je gojišče v optimalnih pogojih, pričakujemo zadovoljivo rast v vseh primerih, razen L. fermentum, ki ima lahko reden pridelek.

Za oceno sterilnosti gojišča moramo v aerobiozi 24 ur inkubirati eno ali dve plošči vsake pripravljene serije (brez inokulacije) pri 37 ° C. Po tem času ne smemo opaziti rasti ali spremembe barve v mediju.

Omejitve

-Agar ne taljemo več kot enkrat.

-Pripravljen medij lahko traja do 3 mesece, če ga hranimo v hladilniku in zaščiten pred svetlobo.

-Ta medij ni primeren za zahtevne ali anaerobne mikroorganizme.

Reference

1. Nacionalna uprava za zdravila, hrano in medicinsko tehnologijo (ANMAT). Mikrobiološka analiza hrane, uradna analitična metodologija, indikatorski mikroorganizmi. Letnik 3. leto 2014 Na voljo na: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Števec plošč Agar. 2009. Dostopno na naslovu: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standardni metodni agar (PCA) v skladu z APHA in ISO 4833. Na voljo na: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Število agar plošč. 2015. Dostopno na: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B in Velázquez O. 2009. Tehnike mikrobiološke analize živil. 2. izd. Fakulteta za kemijo, UNAM. Mehika. Dostopno na: depa.fquim.unam