- Osnove
- Način setve
- Interpretacija
- Priprava
- Uporaba
- Končne misli
- Inokulum
- Posejano
- Intenzivnost barve
- Reference
Agar Simmons citrata je trdna medij uporablja kot biokemijski identifikacijo testne mikroorganizmov, zlasti gram - negativnim bacilov. Prvotni medij je ustvaril Koser leta 1923.
Koserjev citratni medij je bil sestavljen iz brozge, ki vsebuje natrijev fosfat, amonijev fosfat, mono kalijev fosfat, magnezijev sulfat in natrijev citrat.
A. Dehidrirani komercialni medij Citronski agrum Simmons B. Pripravljen Simmons Citrate Agar. Vir: A. Fotografiral mag. Marielsa Gil B. Roto2esdios, z Wikimedia Commons
Kot je razvidno, je edini vir ogljika v gojišču citrat, dušika pa je amonijev fosfat, ki izpušča beljakovine in ogljikove hidrate kot vir teh elementov, ki so običajno prisotni v drugih medijih.
Zato se bakterije, inokulirane v tem mediju, lahko razmnožujejo le, če lahko absorbirajo ogljik iz citrata. Test je bil pozitiven, če je v mediju nastala motnost, vendar je imel slabost, da lahko pride do nespecifične motnosti.
To težavo je Simmons rešil tako, da je Koserjevi prvotni formuli dodal bromothymol blue in agar. Čeprav je načelo enako, se razlaga različno.
Osnove
Nekatere bakterije so sposobne preživeti, če fermentacija ali proizvodnja mlečne kisline ne potrebuje energije, zaradi česar potrebujejo energijo z uporabo drugih substratov. V tem testu je edini ponujeni vir ogljika citrat.
Bakterije, ki lahko preživijo v teh pogojih, hitro presnavljajo citrat v alternativo tradicionalnemu načinu z uporabo cikla trikarboksilne kisline ali cikla fermentacije citrata.
Katabolizem citrata s strani bakterij obsega encimski mehanizem brez posredovanja koencima A. Ta encim je znan kot citraza (citratna oksaloacetatna liza) ali citratna desmolaza. Reakcija zahteva prisotnost dvovalentnega kationa, ki ga v tem primeru oskrbuje magnezij.
Reakcija ustvari oksaloacetat in piruvat, ki nato povzroči nastanek organskih kislin sredi alkalnega pH, ki nastane z uporabo vira dušika. Te organske kisline se uporabljajo kot vir ogljika, ki ustvarja karbonate in bikarbonate, s čimer dodatno alkalizira okolje.
Način setve
Medij Simmons citrata je treba rahlo inokulirati v ribje kroglice z ravno zanko ali iglo in ga inkubirati 24 ur pri 35-37 ° C. Po preteku časa opazimo rezultate.
Seme se opravi samo na površini agarja. Ne prebijajte.
Interpretacija
Če medij ostane prvotne barve (zelena) in ni vidne rasti, je test negativen, če pa medij postane modro, to kaže na prisotnost alkalnih produktov, kar zazna s kazalcem pH. V tem primeru je test pozitiven.
Citrat (+) in (-). Vir: mag. Marielsa gil
To se zgodi, ker če bakterija porabi ogljik iz citrata, lahko tudi prevzame dušik iz amonijevega fosfata, s katerim sprošča amoniak, alkalizira medij.
Na drugi strani, če rast bakterije opazimo v gojišču, ni pa barvne spremembe, je treba preskus šteti tudi za pozitiven, saj če pride do rasti, to pomeni, da so bakterije lahko uporabljale citrat kot vir ogljika, čeprav trenutno ni sprememb pH (včasih lahko traja tudi čas).
Če obstaja dvom v interpretacijo končne barve, ga lahko primerjamo z nevinokulirano citratno cevjo.
Priprava
Za en liter vode se tehta 24,2 g dehidriranega medija. Premešamo in pustimo počivati približno 5 minut. Medij raztopimo tako, da segrevamo 1 ali dve minuti, pri čemer pogosto tresemo.
V epruvete nalijemo 4 ml in 15 minut avtoklaviramo pri 121 ° C. Ko zapustite avtoklavo, se s pomočjo podpornika nagnite tako, da se agar strdi v obliki kljuna piščali z majhnim blokom ali dnom in več poskokom.
Končni pH citratnega medija je 6,9 (zelena barva). Ta medij je zelo občutljiv na spremembe pH.
Pri pH 6 ali manj se medij obarva rumeno. Te barve pri testu na bakterije ni opaziti.
In pri pH 7,6 ali več, medij postane globoko prusko modro.
Uporaba
Simmons Citrate Agar se uporablja za identifikacijo nekaterih mikroorganizmov, zlasti bacilov iz družine Enterobacteriaceae in drugih ne-glukoznih fermentirajočih bacilov.
Vir: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
Končne misli
Simmons citrate medium je zelo občutljiv test, saj lahko pri določenih napakah dobimo lažne pozitivne rezultate.
Paziti je treba naslednje:
Inokulum
Ne sme se delati zelo debelega ali naloženega bakterijskega inokuluma, saj lahko povzroči, da se na mestu sajenja razvije bakreno rumena barva, ne da bi to vplivalo na preostali medij, vendar lahko privede do prepričanja, da pride do rasti. Ne pomeni pozitivnosti testa.
Tudi debel inokulum lahko ustvari lažno pozitiven učinek, ker lahko organske spojine, ki nastanejo v celičnih stenah umirajočih bakterij, sprostijo dovolj ogljika in dušika, da spremenijo indikator pH.
Zato je idealno sejanje z iglo namesto platinskega ročaja, da ne bi odvzeli odvečnega materiala.
Posejano
Po drugi strani, ko se seme baterijskih biokemijskih testov za identifikacijo zadevnega mikroorganizma, je pomembno, da se najprej opravi cepljenje s citratnim testom, da se prepreči prenos beljakovin ali ogljikovih hidratov iz drugega medija.
V teh okoliščinah je mogoče dobiti lažno pozitiven rezultat, ker se bo katera od teh snovi, ki jih vnesemo pomotoma, presnavljala in povzročila spremembo pH.
Drug način, kako se izogniti prenosu snovi, je, da se zanka dobro zažge in med enim testom in drugim vzame nov inokulum.
Paziti je treba tudi, da se dotaknete kolonije, da bi opravili inokulum, saj se je treba izogibati vlečenju dela agarja iz kulture, iz katere prihajajo bakterije, zaradi zgoraj navedenega.
V tem smislu Matsen, Sherris in Branson priporočajo razredčenje inokuluma v fiziološki raztopini pred inokulacijo citratnega testa, da se prepreči prenos drugih virov ogljika.
Intenzivnost barve
Upoštevati je treba, da se intenzivnost barve, ki je nastala, ko je test pozitiven, lahko razlikuje glede na trgovsko hišo.
Poleg tega obstajajo mikroorganizmi, ki pozitivno testirajo po 24 urah, obstajajo pa tudi drugi sevi, ki potrebujejo 48 ur ali več, da pridejo do spremembe pH.
Reference
- Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testi za identifikacijo bakterij kliničnega pomena. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- BD Laboratoriji. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Dostopno na: bd.com
- Britannia Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2015. Dostopno na: britanialab.com
- Diagnostični laboratoriji Valtek. Simmons Citrate Agar. 2016. Dostopno na: andinamedica.com.