REKOMBINANTNA DNK: TEHNIKA, APLIKACIJE IN OSNOVE - BIOLOGIJA - 2026

Rekombinantne DNA (rDNA ali rDNA) je umetno molekula nukleinske kisline povzročajo v laboratoriju, z združitvijo dveh segmentov interesne organizacije. Znan je tudi kot himerna DNK, zahvaljujoč svoji hibridni lastnosti. Te vrste DNK v naravi ne najdemo.

Osnovna metodologija za njegovo ustvarjanje vključuje: (a) izbor ciljne DNK in njeno vstavitev v drug fragment DNK (na splošno bakterijski plazmid); (b) vnos tega plazmida v bakterijo, (c) izbor bakterij z antibiotiki in na koncu (d) izražanje gena.

Vir: pixabay.com

Tehnika izkorišča nabor encimov, ki omogočajo kopiranje in lepljenje določenih fragmentov DNK po presoji raziskovalca.

Cilj rekombinantne tehnologije je v večini primerov izražanje proteina (znanega kot rekombinantni protein), ki ga molekularni biolog želi za prihodnje raziskave ali ustvariti beljakovine komercialne in terapevtske vrednosti - na primer človeški inzulin, na primer

Osnove tehnike rekombinantne DNA in njene uporabe v genskem inženiringu

Osrednja dogma molekularne biologije

Vsa organska bitja, ki jih poznamo, imajo več značilnosti. Ena od njih je narava genskega materiala in način nastajanja beljakovin - proces, znan kot osrednja „dogma“ molekularne biologije.

Z izjemo nekaj virusov vsi organizmi hranijo genetske informacije v DNK (deoksiribonukleinska kislina), zbrani na zelo kompakten in organiziran način v jedru celice.

Za izražanje genov se molekula DNK prepisuje v messenger RNA, slednja pa se prevede v jezik aminokislin, gradnikov beljakovin.

Kaj je rekombinantna DNK?

Med 70. in 80. leti so molekularni biologi začeli izkoriščati procese, ki se naravno pojavljajo znotraj celice in so jih lahko ekstrapolirali v laboratorij.

Na ta način bi lahko v segment DNK iz bakterije vstavili gen živalskega izvora (na primer vretenčar); ali DNK bakterije bi lahko kombinirali z virusno DNK. Tako lahko rekombinantno DNA definiramo kot molekulo, sestavljeno iz DNK iz dveh različnih organizmov.

Ko je ustvarjena ta hibridna ali rekombinantna molekula, se izrazi zanimiv gen. Z besednim izražanjem želimo navesti postopek prevajanja v beljakovine.

Restriktivni encimi in ligaze: ključ procesa

Ključni element pri razvoju rekombinantne DNK tehnologije je bilo odkrivanje restrikcijskih encimov.

To so beljakovinske molekule, ki kažejo sposobnost cepitve DNA (nukleaze) v specifične sekvence, ki služijo kot "molekularne škarje". Fragmenti, ki jih ustvarjajo ti encimi, imenujemo restrikcijski fragmenti.

Omenjeni encimi lahko povzročijo simetrične reze v ciljnem zaporedju (v obeh verigah na isti višini) ali asimetrične reze. Ključni vidik delovanja restriktivnih encimov je, da po cepljenju verige dobimo "ohlapen rob", ki dopolnjuje drugi rob, ki ga isti encim razreže.

Nekaj ​​primerov sta ECOR 1 in Sma 1. Trenutno je znanih in komercialno na voljo več kot 200 vrst restrikcijskih encimov.

Da bi bilo koristno, mora biti s škarjami priloženo lepilo. To tesnilno delovanje DNA (predhodno zdravljene z restrikcijskimi encimi) izvajajo ligaze.

Tehnika: kako se DNK organizma v laboratoriju umetno spreminja?

Spodaj bomo opisali glavne korake, ki jih zahteva rekombinantna DNK tehnologija. Vse izvajajo strokovnjaki v laboratoriju za molekularno biologijo.

Kaj je "klon"?

Preden nadaljujemo z eksperimentalnim protokolom, moramo upoštevati, da se v molekularni biologiji in biotehnologiji široko uporabljata izraza "klon" in glagol "klon". To bi lahko privedlo do zmede.

V tem kontekstu ne mislimo na kloniranje celotnega organizma (kot na primer v primeru znane ovce Dolly), temveč na kloniranje koščka DNK, ki je lahko gen. To pomeni, da nastane veliko kopij - gensko identičnih - zaporedja.

1. Izolacija in pridobivanje DNK

Prvi korak je, da se odločite, katero zaporedje želite uporabiti. To je v celoti odvisno od raziskovalca in ciljev njegovega dela. To DNK je treba nato izolirati in očistiti. Načini in postopki za dosego tega so odvisni od telesa in tkiva.

Na splošno odvzamemo košček tkiva in ga obdelamo v pufru za lizo s proteinazo K (proteolitični encim) in nato ekstrahiramo DNK. Nato se genetski material razdrobi na majhne drobce.

2. Klonirni vektor

Po pripravljalnih korakih želi raziskovalec vstaviti DNK zanimiv segment v klonirajoči vektor. Odslej bomo ta segment DNK imenovali bela DNK.

Plazmidi

Eden najbolj uporabljenih vektorjev v plazmidu bakterijskega izvora. Plazmid je dvoverižna krožna molekula DNK, ki jo naravno najdemo v bakterijah. Bakterijskim kromosomom so tuje - torej so ekstrahromosomske in jih naravno najdemo v teh prokariotih.

Osnovni elementi vektorja so: (a) izvor podvajanja, ki omogoča sintezo DNK; (b) selekcijsko sredstvo, ki omogoča identifikacijo organizmov, ki prenašajo plazmid s ciljno DNK, kot je odpornost na neki antibiotik; in (c) mesto za večkratno koloniranje, kjer najdemo sekvence, ki jih prepoznajo restrikcijski encimi.

Prvo uspešno rekombinantno DNK v laboratoriju smo klonirali v plazmid pSC101 iz bakterije E. coli. Ta poleg izvora replikacije vsebuje mesto restrikcije za restrikcijski encim EcoRI in gen za odpornost na antibiotik.

Vstavitev ciljne DNK v plazmid poteka s pomočjo molekularnih orodij restrikcijskih encimov in ligaz, opisanih v prejšnjem razdelku.

Preostale vrste vektorjev

Poleg plazmidov lahko DNK vstavimo v druge vektorje, kot so bakteriofag lambda, kozmidi, YAC (kvasni umetni kromosomi), BAC (umetni bakterijski kromosomi) in fagemidi.

3. Uvedba rekombinantne DNA

Ko dobimo rekombinantno molekulo DNA (gen, ki nas zanima plazmid ali drug vektor), ga vnesemo v gostitelja ali gostiteljskega organizma, ki je lahko bakterija.

Za vnos tuje DNK v bakterijo uporabljamo tehniko, imenovano bakterijska transformacija, pri kateri organizem podvržemo zdravljenju z dvovalentnimi kationi, zaradi česar je dovzeten za sprejem DNK.

Metodološko ne moremo zagotoviti, da je 100% bakterij v naši kulturi učinkovito prevzelo našo rekombinantno molekulo DNA. Tu nastopi del plazmida, ki vsebuje odpornost na antibiotike.

Tako bodo bakterije, ki so prevzele plazmid, odporne na določen antibiotik. Če jih želite izbrati, bo dovolj, da uporabite omenjeni antibiotik in vzamete preživele.

4. Beljake "spravite"

Po izbiri bakterij z našo rekombinantno DNK nadaljujemo z uporabo gostiteljevega encimskega mehanizma za ustvarjanje zanimivega proteina. Ko se bakterije razmnožujejo, se plazmid prenaša na njihove potomce, zato se med delitvijo ne izgubi.

Ta postopek bakterije uporablja kot nekakšno "tovarno" beljakovin. Kasneje bomo videli, da je šlo za zelo relevanten postopek pri razvoju učinkovitega zdravljenja.

Ko je kultura pripravljena in bakterije proizvajajo velike količine beljakovin, se celica lizira ali uniči. Obstaja široka paleta biokemijskih tehnik, ki omogočajo čiščenje beljakovin glede na njihove fizikalno-kemijske značilnosti.

V drugem eksperimentalnem okviru nas morda ne bo ustvarilo beljakovin, ampak nas zanima pridobitev sekvence DNK kot take. Če bi bilo to tako, bi plazmid uporabili za ustvarjanje več kopij fragmenta, ki nas zanima, da bi imeli dovolj ciljne DNK, da bi izvedli ustrezne poskuse.

Prijave

Rekombinantna tehnologija DNK je odprla nešteto možnosti na področju molekularne biologije, biotehnologije, medicine in drugih sorodnih področij. Njene najbolj izjemne aplikacije so naslednje.

Genska analiza

Prva uporaba je neposredno povezana z laboratoriji za molekularno biologijo. Rekombinantna tehnologija DNA omogoča raziskovalcem, da razumejo normalno delovanje genov, ustvarjene beljakovine pa lahko uporabijo pri nadaljnjih raziskavah.

Farmacevtska industrija

Proteini, proizvedeni po postopku rekombinantne DNK, imajo uporabo v medicini. Dva zelo pomembna primera na tem področju sta človeški inzulin in rastni hormon, ki se uporablja pri bolnikih, ki jim ta protein ne primanjkuje.

Zahvaljujoč rekombinantni DNK lahko te beljakovine nastanejo, ne da bi jih morali izločiti iz drugega človeka, kar predstavlja dodatne metodološke zaplete in tveganje za zdravje. To je pomagalo izboljšati kakovost življenja neštetih bolnikov.

Reference

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologija 2. Grupo uredništvo Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE in Hausman, RE (2000). Celica: molekularni pristop (letnik 10). Washington, DC: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Biokemija: učbenik s kliničnimi aplikacijami. Sem obrnil.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Vloga tehnologije rekombinantne DNA za izboljšanje življenja. Mednarodna revija genomike, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patološka anatomija. Elsevier Španija.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Uvod v mikrobiologijo. Panamerican Medical Ed.
7. The MJ (1989). Človeški inzulin: prvo zdravilo DNK tehnologije. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.